Construcción de los genomas adenovirales helper y Ad controles

Para la generación de los Ad helper y Ad controles nos basamos en el genoma adenoviral de serotipo 5 (Ad5), flanqueando su señal de empaquetamiento con diferentes combinaciones de secuencias de recombinación para las recombinasas Cre (loxP) y ΦC31 (attB/attP). El genoma adenoviral Ad5 está clonado en el plásmido pKP1.4 que contiene toda la región viral codificante con la excepción de parte de la región E1 y parte de la región E3. Asimismo, como plásmido lanzadera, se ha utilizado el plásmido pTG-6600 que contiene los 4262 nucleótidos iniciales del plásmido pKP1.4.

• Para eliminar la región de clonación múltiple (MCS) del plásmido pTG- 6600, éste se digirió con los enzimas EcoRI y MfeI generando 3

fragmentos de 5310, 616 y 183 pb. Los fragmentos de 5310 y 616 pb fueron religados para generar el plásmido pTG-6600ΔCMV.

• El plásmido pBCPB+ fue digerido por SpeI para obtener la secuencia de recombinación attP (221 nucleótidos). La banda de 221 pb fue clonada en el plásmido pTG-6600ΔCMV digerido por SpeI para generar el plásmido pTG-6600ΔCMVattP.

• Los plásmidos pKS-RSV/GFP y pTG-6600ΔCMVattP fueron digeridos por las dianas SalI y SpeI y la banda de GFP fue ligada al plásmido pTG-6600ΔCMVattP para generar el plásmido pRAF2.1 (pTG- 6600ΔCMVGFPattP).

• A continuación, se realizó mutagénesis dirigida contra la diana SgrAI en la posición 189 del Ad, ya que el enzima SgrAI tiene una alta actividad estrella. La mutagénesis dirigida se realizó con los cebadores MutDIRAgeI y MutREVAgeI para introducir la diana AgeI y generar el plásmido pTG-6600(AgeI)ΔCMVGFPattP.

• Las secuencias de recombinación attB+loxP fueron clonadas en el vector pGEMT-easy para generar el plásmido pGEMT-attBloxP utilizando los cebadores attBloxP-DIR y attBloxP-REV. Los plásmidos pGEMT-attBloxP y pTG-6600(AgeI)ΔCMVGFPattP fueron digeridos por la diana AgeI y posteriormente, la banda de 140 pb fue clonada en AgeI para generar el vector pRAF5.1.

• A continuación, el plásmido pRAF5.1 fue digerido por la diana NotI para eliminar la región loxP, y seguidamente religado para generar el plásmido pRAF1.2.

• La secuencia loxP+GFP fue amplificada utilizando los cebadores loxPGFP-DIR y loxPGFP-REV sobre el plásmido pKS-RSV/GFP. La banda amplificada se clonó en el plásmido pGEMT-easy para generar finalmente el plásmido pGEMT-GFPloxP. El producto de PCR fue digerido por la diana SalI y clonado enel plásmido pRAF5.1 digerido por SalI y XhoI para generar el plásmido pRAF4.1.

• Asimismo, se realizó una nueva PCR con los cebadores loxP-GFP- DIR/SpeI y loxP-GFP-DIR/SalI utilizando el plásmido pGEMT-loxPGFP para amplificar una banda 1.7Kpb. Esta banda digerida por las dianas SpeI y SalI se clonó en el plásmido pRAF5.1 digerido por las dianas SpeI y SalI para generar finalmente el plásmido pRAF3.2.

• Para reducir la probabilidad de aparición de partículas RCA, se eliminó toda región viral codificante de la región E1 en los plásmidos pRAF1.2, pRAF4.1 y pRAF3.2. Para ello, se realizó mutagénesis dirigida contra la diana AflII del plásmido pTG-6600 en la posición 2016 para introducir la diana XhoI con los cebadores 6600XhoIDIR y 6600XhoIREV y así generar el plásmido pTG-6600/XhoI. El plásmido pTG-6600/XhoI se digirió por la diana XhoI para eliminar una banda de 486 pb y se religó para generar el plásmido pTG-6600ΔE1.

• Los plásmidos pTG-6600ΔE1, pRAF1.2 y pRAF3.2 fueron digeridos por las dianas XhoI y PacI para extraer una banda de 4101 pb del pTG- 6600ΔE1 y clonarla en la banda de aproximadamente 2.3-2.4 Kpb de los plásmidos pRAF1.2 y pRAF3.2 y de este modo, generar los plásmidos pRAF1.2ΔE1 y pRAF3.2ΔE1.

• A continuación, se realizó una PCR sobre el plásmido pKS-RSV/GFP, para amplificar el cassette de GFP con la secuencia loxP (1.7Kpb), con los cebadores loxP/GFP-DIR y loxP/GFP-REV. El plásmido pRAF5.1 se

digirió con SalI y XhoI y se ligó a la banda de PCR amplificada y digerida por SalI para generar el plásmido pRAF4.1ΔE1.

Figura 12. Esquema de construcción de los diferentes plásmidos lanzadera.

• Para generar un genoma adenovirus control con un cassette para RFP (proteína roja fluorescente; con localización mitocondrial), los plásmidos pDSRed2-Mito y pTG-6600 fueron digeridos por las dianas SnaBI y EcoRI. La banda de 1149 pb del plásmido pDRed2-Mito fue ligada a la banda de 5685 pb del plásmido pTG-6600 para generar el plásmido pTG-6600/RFP.

Previamente a la recombinación homóloga, el plásmido pKP1.4ΔCMV fue digerido por la diana SwaI y los plásmidos pRAF2.1, pRAF5.1, pRAF1.2 ΔE1, pRAF4.1 ΔE1, pRAF3.2 ΔE1 (figura 12) y pTG6600/RFP fueron digeridos por diferentes dianas exteriores a la zona de de incorporación (FspI, XmnI y/o AseI). Al realizar la recombinación homóloga en células BJ5183, se generaron los siguientes genomas helper y controles: pAd5/attP, pAd5/loxP.FC31, pAd5/FC31, pAd5/attB.Cre, pAd5/FC31.Cre y pAd5/RFP (figura 13). Para descartar cualquier posible mutación, se secuenciaron todas las construcciones desde el ITR5’ hasta el nucleótido 5788 del Ad5, que era el último nucleótido

posible que permitía la recombinación homóloga entre ambos plásmidos (Servicio de secuenciación de la Universidad Autónoma de Barcelona, Bellaterra, España).

Figura 13. Esquema de las diferentes construcciones de genomas adenovirales helper y

controles. Los gráficos no están a escala real.