Análisis bioquímicos en probióticos, pienso, hígado y músculo de ejemplares

Lgh41/01. En todos los casos, las dosis elegidas fueron de 4.8x104 - 2.4x105 ufc g-1,

dada la dosis letal 50 (DL50) registrada para lenguado por Díaz-Rosales et al. (2009). Diariamente y a lo largo de todas las experiencias, se registró la mortalidad en todos los grupos estudiados, comprobándose la presencia ó no del patógeno en los órganos internos de los ejemplares muertos (bazo, hígado y riñón), mediante siembra de los mismos en placas de TSAs (22 ºC durante 48 horas) y posterior confirmación con el test de anticuerpos Mono-Pp (BIONOR, Skien Noruega).

Una vez finalizadas las pruebas y para poder evaluar la eficacia del probiótico añadido, se calculó el porcentaje de supervivencia relativa (RPS) descrito por Amend (1981) como:

RPS = [1- (% MP / % MC)] x 100

donde % MP es el porcentaje de mortalidad de los peces alimentados con el probiótico, y % MC es el porcentaje de mortalidad de los peces control

4. Análisis bioquímicos en probióticos, pienso, hígado y músculo de

ejemplares

Para la determinación de la existencia ó no de diferencias a nivel de composición corporal entre los ejemplares alimentados con las dietas estudiadas al término de todas las experiencias, se tomaron al azar seis juveniles de lenguado senegalés de cada dieta. Dichos peces fueron anestesiados con una solución de aceite de clavo y etanol (40 ppm) como quedó descrito en la sección anterior. Seguidamente, se extrajeron muestras del músculo del lado ciego de la zona media dorsal pigmentada, tras la eliminación de la

piel. Asimismo, se tomaron muestras del hígado. Todas las muestras fueron conservadas a -80 ºC hasta su posterior análisis. También se determinó por triplicado la composición proximal de uno de los piensos utilizados y de las dos cepas probióticas ensayadas.

4.1. Medida de proteínas

La concentración de proteínas fue determinada por el método de Bradford (1976). Dicho método está basado en la reacción que tiene lugar en la solución acuosa del reactivo Comasie G-250 ó de Bradford. Este reactivo, en presencia de ácido fosfórico y en un entorno hidrofóbico proteico, produce una coloración azul intensa, susceptible de ser medida por espectrofotometría a 595 nm. Para la realización de la recta patrón en nuestras experiencias se utilizó albúmina de suero bovino (BSA, Sigma-Aldrich), a concentraciones entre 1500-125 μg mL-1.

Para la determinación de la concentración de proteínas en hígado, músculo, pienso ó probiótico se pesaron 5 mg de peso seco de cada muestra, que se colocaron en tubos de 18 mL. Se añadieron 500 μL de hidróxido sódico 1N, agitándose durante 30 minutos. A continuación se añadieron 2,5 mL de agua destilada, se sonicaron las muestras y se añadieron de nuevo 2 mL de agua destilada. Se tomaron entonces 50 μL de cada dilución patrón y se pasaron a tubos de 15 mL, haciendo lo mismo con un blanco de agua destilada. El mismo método se aplicó a las muestras, obteniéndose tres alícuotas de las mismas. Finalmente, se añadió 1,5 mL de reactivo Coomasie, previamente atemperado y homogeneizado, a cada una de las muestras e inmediatamente se procedió a su lectura en espectrofotómetro a 595 nm. Una vez realizadas las determinaciones de todas las muestras, se restó el valor del blanco y se aplicaron los resultados así obtenidos sobre la curva patrón, determinando la concentración de proteínas totales.

4.2. Medida de lípidos totales

Los lípidos totales fueron analizados mediante extracción con cloroformo-metanol (2:1) por el método de Bligh y Dyer (1959), modificado por Fernández Reiriz et al. (1989) y posterior determinación gravimétrica.

Para hacer los extractos, se pesaron de 25-30 mg de peso seco por muestra en tubos de 18 mL. Se homogenizaron en 2 mL de agua destilada y se sonicaron. La primera extracción se realizó con 2,5 mL de cloroformo + 2,6-Di-Ter-butil-4-metilfenol (BHT, B-1378, Sigma-Aldrich) y 5 mL de metanol, centrifugándose a 3000 rpm durante 30 minutos. Se recogió el sobrenadante en tubo de 25 mL. Se llevó a cabo una segunda extracción, añadiendo al sedimento 2 mL de cloroformo + BHT y 1 mL de metanol y centrifugándose a 3000 rpm durante 30 minutos. Se recogió el sobrenadante junto con el extraído anteriormente en tubo de 25 mL. A continuación, se realizó la purificación del sobrenadante con 7,5 mL de cloroformo + BHT y 2,5 mL de agua destilada en una nueva centrifugación a 3000 rpm durante 30 minutos. La fase superior se descartó en su mayor parte, dejando un poco junto con la fase inferior en tubo graduado de fondo redondo sellado con teflón hasta el día siguiente (8 ºC), para su estabilización. La determinación se realizó por gravimetría en balanza analítica.

4.3. Análisis de ácidos grasos

Los ácidos grasos se analizaron en el cromatógrafo de gases (8700 Perkin Elmer, Beaconsfield, Inglaterra) previa transesterification y metilación (Lepage y Roy, 1986).

Se colocó cada una de las muestras a analizar en un tubo de 18 mL, se añadió el volumen necesario (300-400 μg de lípidos) y 100 μg de patrón interno 19:0. Se agitó y procedió a la evaporación del disolvente por sequedad. Para la obtención de los ésteres metílicos de los ácidos grasos se añadieron 0,4 mL de tolueno y 1,5 mL de ácido sulfúrico-metanol al 1,5%. Se agitó y se colocó en estufa a 50 ºC durante 16 horas. Una vez atemperada la muestra, se procedió a detener la transesterificación y neutralizarla añadiendo l5 mL de carbonato potásico al 6%. Se agitó para homogeneizar y se centrifugó a 3000 rpm durante 12 minutos, quedando los ésteres metílicos de los ácidos grasos en la fase superior. En un tubo cónico con tapón de vidrio, se añadió a la fase superior sulfato sódico anhidro para la retención de impurezas, y se inyectó 1 μL de la disolución de ésteres metílicos (aprox. 1μg μL-1).

Los ésteres metílicos se analizaron por cromatografía de gases en un Perkin Elmer, modelo Autosystem XL, provisto de un inyector split-splitless, temperatura programada y detector de ionización de llama (FID). La separación de los ésteres metílicos se realizó en una columna capilar SP-2330 (Supelco, Bellefonte, Estados Unidos) de 30 cm. de longitud y 0.25 mm de diámetro interno. La determinación cuantitativa se realizó mediante la adición a las muestras de un patrón interno (19:0, ácido nonadecanoico) y la comparación con un patrón comercial (Larodan, Halmö, Suecia).

Para la obtención y tratamiento de los datos se utilizó el software Totalchrom suministrado por Perkin Elmer