Análisis comparativo del transcriptoma de las cepas H37Rv, C27, C32 y C49 Para intentar dilucidar la base genética de las variaciones observadas en los

fenotipos rojo neutro y PDIM, se comparó la expresión génica global de una cepa RN− (C32) con la de tres cepas RN+ [C27, C49 y H37Rv (ATCC 27294)], y de dos cepas PDIM− (C32 y C27) con la de dos cepas PDIM+ [C49 y H37Rv (ATCC 27294)]. En el Anexo se muestran los valores de expresión normalizados de los genes con una expresión significativamente diferente en las distintas comparaciones realizadas.

La comparación del transcriptoma de la cepa C32 (RN−) con los de las cepas C27 y H37Rv (RN+), no permitió detectar ningún gen con una expresión significativamente diferente. Sin embargo, cuando la misma cepa C32 se contrastó con la cepa C49 (RN+) se detectaron 5 genes con una expresión diferencial: el gen Rv1576c

que codificaría la proteína de la cápside del profago phiRv1 (inducido 3,9 veces, p=0,039); el operón formado por los genes Rv3160c-Rv3161c que codifican un posible

regulador transcripcional y una dioxigenasa (inducidos 3,7 y 4,9 veces respectivamente, p=0,039); el gen Rv3312A cuyo producto es un antígeno secretado que formaría los

recién descritos pilis de M. tuberculosis (Alteri et al., 2007) (reprimido en un factor de

0,5 p=0,0375); y el gen Rv3706c que codifica una proteína conservada rica en prolina,

de función desconocida (reprimido en un factor de 0,4 p=0,0198).

Si se agrupaban las tres cepas RN+ (C27, C49 y H37Rv), y se comparaban con la cepa C32 (RN−) aparecían 4 genes con una expresión diferencial significativa (Fig. 4.22 y Tabla 8.6 en Anexo): el gen Rv2452c que codifica una pequeña proteína hipotética de

función desconocida (inducido 2,8 veces en la cepa RN−, p=0,0481); los genes

Rv3160c-Rv3161c (inducidos 3,2 y 4,1 veces en la cepa RN−, p=0,0365 y p=0,0402); y

tres últimos genes también habían presentado una expresión diferencial al comparar la cepa C32 con la cepa C49. Por lo tanto estos genes, o alguno/s de ellos, podrían estar relacionados con el fenotipo RN− de la cepa C32.

En cuanto al fenotipo PDIM, cuando se comparó la cepa C27 (PDIM−) con la cepa H37Rv (PDIM+) se detectaron 2 genes con una expresión disminuida: el gen

Rv2940c o mas (0,4 p=0,0164) que codifica la sintasa de ácidos micocerósicos de los

PDIM; y el gen Rv3562 o fadE31 (0,6 p=0,042), una posible acil-CoA deshidrogenasa

(Tabla 8.7 en Anexo). El gen mas de síntesis de PDIM se encontraba también reprimido

en la cepa C27 (PDIM−) en comparación con la cepa C49 (PDIM+), si bien en este caso el número de genes con una expresión diferencial ascendió hasta 22 (Tabla 4.5, y Tabla 8.8 en Anexo). Así mismo, si se agrupaban las dos cepas PDIM− (C27 y C32) y se comparaban con las dos cepas PDIM+ (C49 y H37Rv), el único gen que presentaba una expresión significativamente diferente era el gen mas (Fig. 4.23), que se encontraba

reprimido en un factor de 0,4 en las cepas PDIM− (p=7,8x10−5). Por lo tanto, la menor expresión de este gen en las cepas C27 y C32 explicaría, muy probablemente, la ausencia de PDIM en estas cepas.

Figura 4.22. Genes diferencialmente expresados en la cepa C32 (RN−_{) respecto a las cepas RN}+_.

Valor de la expresión de cada gen A) según el fenotipo rojo neutro, y B) en cada cepa analizada. Los genes están coloreados según el nivel de expresión en la cepa C32. Gráficas generadas por el programa GeneSpring. Expresi ón n ormaliza da RN− _RN+ Rv3160c-Rv3161c Rv2452c Rv3706c A Rv2452c Rv3160c-Rv3161c Rv3706c C27 C32 C49 Rv B

Tabla 4.5. Genes diferencialmente expresados en la cepa C27 respecto a la C49. Gen _represiónFactor de 1 Valor _{de p} Descripción

Rv0244c (fadE5) 0,5 0,0178 - Probable acil-CoA deshidrogenasa Rv0284 0,5 0,0432 - Proteína de membrana conservada Rv0286(PPE4) 0,6 0,036 - Miembro de la familia de proteínas PPE Rv0288 (cfp7 o TB10.4) 0,4 0,0376 - Antígeno rico en alanina de la familia ESAT-6 Rv0314c 0,7 0,0178 - Proteína de membrana conservada

Rv0469(umaA) 0,6 0,0471 - Síntesis/modificación de los ácidos micólicos Rv0634B (rpmG2) 0,6 0,0178 - Posible proteína ribosómica L33

Rv0909 0,6 0,0336 - Proteína hipotética conservada Rv0965c 0,6 0,0471 - Proteína hipotética conservada Rv1169c (PE11) 0,5 0,0315 - Miembro de la familia de proteínas PE Rv1172c (PE12) 0,7 0,0463 - Miembro de la familia de proteínas PE Rv1460 0,6 0,0442 - Probable regulador transcripcional Rv1899c(lppD) 0,6 0,0178 - Probable lipoproteína

Rv1980c (mpt64) 0,6 0,0178 - Proteína inmunogénica exportada

Rv2428 (ahpC) 0,5 0,0463 - _{estrés oxidativo y resistencia a la isoniazida} Alquil hidroxiperóxido reductasa. Respuesta al Rv2472 0,6 0,0471 - Proteína hipotética conservada

Rv2816c 0,6 0,0178 - Proteína hipotética conservada Rv2940c (mas) 0,3 0,025 - Ácido micocerósico sintasa

Figura 4.23. Expresión del gen mas en las cepas PDIM− y en las cepas PDIM+. A) Expresión según el fenotipo PDIM. B) Expresión en cada cepa. El color corresponde a la expresión en las cepas PDIM− _y en la cepa C27, respectivamente. Gráficas generadas por el programa GeneSpring.

PDIM− _PDIM+ Expresi ón n ormaliza da A C27 C32 C49 Rv B

Gen _represiónFactor de 1 Valor _{de p} Descripción

Rv2949c 0,5 0,0432 - _{de derivados del ácido} Corismato-piruvato liasa implicada en la síntesis p-hidroxibenzoico y PGL Rv2956 0,6 0,0463 - Proteína hipotética conservada

Rv3019c 0,5 0,025 - Proteína de la familia ESAT-6

Rv3269 0,4 0,0471 - Proteína hipotética similar a chaperonas

5. Discusión

5.1. Los genes Rv0576-Rv0577 y la tinción con rojo neutro

Desde la década de 1950 se sabe que las cepas virulentas de M. tuberculosis

pueden distinguirse de las cepas avirulentas y de las micobacterias saprófitas por su capacidad de adsorber el colorante rojo neutro en su forma catiónica roja. Aunque inicialmente se atribuyó esta reacción al SL, trabajos posteriores refutaron esta relación (Soto, C. Y., 2002; Andreu et al., 2004a) y, por lo tanto, reabrieron la pregunta de cuál

era la molécula responsable de este comportamiento en las cepas virulentas de

M. tuberculosis.

En nuestro laboratorio, en colaboración con los laboratorios de la Dra. Marina Luquin (UAB) y del Dr. Carlos Martín (Universidad de Zaragoza), se inició un estudio para intentar establecer las bases moleculares de la tinción con rojo neutro. Se construyó una cosmidoteca de M. tuberculosis H37Rv en M. smegmatis y se seleccionaron los

clones recombinantes RN+ (Soto, C. Y., 2002). Esta estrategia permitió demostrar que la expresión heteróloga del gen Rv0577 en M. smegmatis era suficiente para conferir a este

microorganismo la capacidad de fijar el rojo neutro en su forma acídica (Andreu et al.,

2004b). Así mismo, se estableció que este gen formaba un operón con el gen Rv0576, el

cual codificaba un posible regulador transcripcional (Andreu et al., 2004b). El siguiente

paso, y objetivo principal de esta tesis, era estudiar la implicación de los genes Rv0576-

Rv0577 en la tinción con rojo neutro en M. tuberculosis.