Métodos microbiológicos

3.2.1. Medios de cultivo, antibióticos y otras soluciones 3.2.1.1. Medios de cultivo

Medio LB (Luria Bertani) (Miller, J. H., 1992)

Triptona 10 g

Extracto de levadura 5 g

NaCl 10 g

Agar (Sólo medios sólido) 17 g

Añadir 1 L de agua destilada y esterilizar en la autoclave durante 15 min a 121ºC. Dispensar en placas de Petri y guardar a 4ºC. En el caso de medio LB líquido, disolver completamente el medio y dispensarlo antes de esterilizarlo; guardar a temperatura ambiente.

Nombre SecuenciaA 5’-3’ Posición Aplicación

IFN-g s AGCGGCTGACTGAACTCAGATTGTAG

Oligo. directo utilizado en la amplificación del gen Ifng por

Real-Time PCR

IFN-g as GTCACAGTTTTCAGCTGTATAGGG Oligo. reverso utilizado en la amplificación del gen Ifng por

Real-Time PCR

TNF-a s CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA

Oligo. directo utilizado en la amplificación del gen Tnf por Real-

Time PCR

TNF-a as TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC

Oligo. reverso utilizado en la amplificación del gen Tnf por Real-

Time PCR

INOS s CAGCTGGGCTGTACAAACCTT Oligo. directo utilizado en la amplificación del gen Nos2 por

Real-Time PCR

INOS as CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG

Oligo. reverso utilizado en la amplificación del gen Nos2 por Real-Time PCR

RANTES s GAAGGAACCGCCAAGT

Oligo. directo utilizado en la amplificación del gen Ccl5 por

Real-Time PCR RANTES

as AGAGCAAGCGATGACAG

Oligo. reverso utilizado en la amplificación del gen Ccl5 por

Medio TB (Terrific Broth) (Tartof y Hobbs, 1987)

Triptona 12 g

Extracto de levadura 24 g

Glicerol 4 mL

Añadir 900 mL de agua destilada y esterilizar en la autoclave (15 min a 121ºC). Dejar enfriar hasta 50ºC-60ºC y añadir 100 mL de la siguiente solución salina previamente esterilizada en la autoclave:

KH2PO4 0,17 M

K2HPO4 0,72 M

Dispensar en condiciones de esterilidad, en botellas de 100 mL estériles. Incubar 24 h a 37ºC para comprobar que no se ha contaminado el medio. Desechar aquellas botellas en las que se observe crecimiento y guardar el resto a temperatura ambiente.

Medio Middlebrook 7H9

Middlebrook 7H9 broth (Difco) 4,7 g

Tween 80 0,5 mL

Añadir 900 mL de agua destilada y disolver con agitación y temperatura. Esterilizar en la autoclave a 121ºC durante 10 min. Dejar enfriar hasta 50ºC-60ºC y añadir 100 mL de suplemento ADC estéril. Para cultivos de menor volumen es conveniente preparar alícuotas de 90 mL de medio en botellas de 100 mL y autoclavar por separado, para minimizar la manipulación del medio y evitar contaminaciones.

Suplemento ADC:

BSA (Albúmina sérica bovina) fracción V 5 g

Glucosa 2 g

Catalasa 3 mg

Disolver completamente en 70 mL de agua destilada. Ajustar el volumen a 100 mL con agua destilada y esterilizar por filtración con filtros de 0,22 μm de diámetro de poro. Para cultivos de menor volumen recoger el filtrado en alícuotas de 10 mL. Incubar 24 h a 37ºC para descartar contaminaciones. Guardar a 4ºC.

Medio Middlebrook 7H10

Middlebrook 7H10 agar (Difco) 19 g

Glicerol 5 mL

Añadir 895 mL de agua destilada y disolver con agitación y temperatura. Esterilizar en la autoclave a 121ºC durante 10 min. Dejar enfriar hasta 50ºC-60ºC y añadir 100 mL del suplemento OADC estéril. Dispensar en placas de Petri y guardar a 4ºC.

Suplemento OADC: BSA fracción V 5 g Glucosa 2 g Catalasa 4 mg Ácido oleico 0,056 mL NaCl 0,85 g

Disolver completamente en 70 mL de agua destilada. Ajustar el volumen a 100 mL con agua destilada y esterilizar por filtración con filtros de 0,22 μm de diámetro de poro. Incubar 24 h a 37ºC para detectar posibles contaminaciones. Guardar a 4ºC.

Medio Middlebrook 7H10 con rojo neutro (Andreu et al., 2004b)

Middlebrook 7H10 agar (Difco) 19 g

Glicerol 5 mL

Añadir 645 mL de agua destilada y disolver con agitación y temperatura. Añadir 250 mL de solución de rojo neutro. Esterilizar en la autoclave a 121ºC durante 10 min. Dejar enfriar hasta 50ºC-60ºC y añadir 100 mL del suplemento OADC estéril. Dispensar en placas de Petri y guardar a 4ºC, protegido de la luz, no más de 2 meses. Solución de rojo neutro:

Rojo neutro (Sigma) 0,2 % (p/v) 0,250 mL Sodio 5,5-dietilbarbiturato (Panreac) 2,5 g

NaCl 15 g

Disolver el sodio 5,5-dietilbarbiturato y el NaCl en agua destilada. Ajustar a un volumen final de 250 mL. Medir el pH y ajustar a 9,8 si fuera necesario. Añadir 0,250 mL de rojo neutro al 0,2% en agua (p/v).

3.2.1.2. Antibióticos

Los antibióticos utilizados se disolvieron en agua desionizada y se esterilizaron por filtración con filtros de 0,22 μm; excepto la higromicina que se compraba en solución estéril (Roche). Se preparaban soluciones stock 1000 veces concentradas que

se guardaban a −20ºC y se utilizaban directamente para suplementar los medios sólidos, enfriados a unos 50ºC-60ºC, antes de preparar las placas. Estas soluciones se diluían 10 veces con agua desionizada estéril para obtener una solución de trabajo que se conservaba a 4ºC y que se añadía directamente a los medios líquidos. Las concentraciones de los antibióticos utilizados en este trabajo se detallan en la Tabla 3.4.

Tabla 3.4. Concentraciones de los antibióticos utilizados para los cultivos de E. coli, M. smegmatis y M. tuberculosis.

3.2.1.3. Otras soluciones

Los medios de cultivo se suplementaron con otras soluciones en determinadas pruebas realizadas en este trabajo.

5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-gal)

Se utilizó, disuelto en N,N dimetil formamida, para suplementar las placas de LB

a una concentración de 40 μg/mL y las placas de Middlebrook 7H10 a una concentración de 50 μg/mL, a partir de una solución stock de 40 mg/mL.

Sacarosa

Se utilizó una solución stock a una concentración del 50%, esterilizada por

filtración, para suplementar las placas de Middlebrook 7H10 a una concentración final del 2% (p/v). Puesto que el volumen que se debe añadir es importante, el medio de cultivo se disolvía en un volumen de agua proporcionalmente menor para que el volumen final quedara ajustado.

Conc. final (μg/mL)

Antibiótico Conc. stock

mg/mL _{E. coli Mycobacterium}

Ampicilina 50 50

Kanamicina monosulfato (Km) 50 50 25

Higromicina B (Hyg) (Roche) 50 100 100

Acetamida

Se utilizó para suplementar medios líquidos de Middlebrook 7H9 a una concentración del 0,2% (p/v), usando una solución stock 10 veces concentrada

esterilizada por filtración.

3.2.2. Condiciones de crecimiento y conservación de las cepas 3.2.2.1. Escherichia coli

Los cultivos de las diferentes cepas bacterianas de E. coli se realizaron en medio

líquido LB, mientras que los cultivos de noche para extracciones de DNA plasmídico se realizaron en el medio altamente rico TB. Cuando se requería, estos medios se suplementaban con las concentraciones de antibióticos adecuadas (Tabla 3.4). Se partía de una colonia aislada del microorganismo que se inoculaba en 10 mL de medio y se incubaba a 37ºC con una agitación de 180 rpm-220 rpm. El crecimiento del cultivo se controlaba, en caso necesario, midiendo la densidad óptica (OD) a una longitud de onda de 550 nm. Las siembras en medio sólido se realizaron en placas de Petri con medio LB, con los suplementos adecuados, y se incubaron a 37ºC.

Las cepas de E. coli se conservaban en placas de LB, suplementadas según el

caso, mantenidas a 4ºC y resembradas mensualmente. También se mantenían las cepas congeladas a −20ºC en viales de cultivo glicerinados [glicerol a una concentración final del 20% (v/v)].

3.2.2.2. Mycobacterium

Los cultivos de las diferentes cepas bacterianas de M. smegmatis y

M. tuberculosis se realizaron en medio líquido Middlebrook 7H9 con los suplementos

indicados. En el caso de M. smegmatis se partía de una colonia aislada que se inoculaba

en 10 mL de medio y se incubaba a 37ºC con una agitación de 200 rpm durante 3- 5 días. Los cultivos de M. tuberculosis se realizaban en frascos de cultivo (TPP) de

25 cm2 para 10 mL de medio (75 cm2 para 100 mL) que se incubaban en la estufa a 37ºC durante 3 semanas. Estos cultivos se utilizaban como inóculo para cultivos de mayor volumen realizando una dilución 1/100 e incubándolos, en las mismas condiciones, durante 24 h-48 h en el caso de M. smegmatis y durante 1 semana en el de

M. tuberculosis. El seguimiento del crecimiento se llevaba a cabo midiendo la OD a una

longitud de onda de 600 nm. Teniendo en cuenta el lento crecimiento de

incubando una alícuota en las mismas condiciones que los cultivos, para asegurarnos de que no hay contaminantes.

Las siembras en medio sólido se realizaron en placas de Petri con medio Middlebrook 7H10 suplementado según el caso. Las placas de M. smegmatis se

incubaban a 37ºC durante 3-5 días y durante 3-4 semanas las de M. tuberculosis. En

ambos casos, para evitar la desecación, las placas se sellaban con dos capas de Parafilm® y, además, las placas de M. tuberculosis se incubaban dentro de bolsas.

Las cepas de M. smegmatis se conservaban en las placas mantenidas a 4ºC y

resembradas mensualmente. Las cepas de M. tuberculosis se conservaban a 37ºC y se

resembraban cada 4-6 semanas. También se mantenían las cepas congeladas a −20ºC en viales con leche descremada al 20% (p/v).

La manipulación de M. tuberculosis se llevó a cabo en el laboratorio NSB-3

IBF/014.2 situado en el Institut de Biotecnologia i de Biomedicina de la UAB, donde se dispone de las barreras físicas, equipamiento y procedimientos de trabajo que garantizan la seguridad necesaria para trabajar con microorganismos de nivel 3 y, más concretamente, con M. tuberculosis. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo

con las especificaciones del “Manual de seguridad y procedimientos normalizados de trabajo” del propio laboratorio, cuya finalidad es asegurar que los trabajos que se realizan cumplen la legislación vigente, tanto española como europea, así como las directrices recomendadas por la OMS, el “Centers for Disease Control y Prevention” (CDC) y el “National Institutes of Health” (NIH) de los EEUU. De este modo se siguieron procedimientos de bioseguridad y de funcionamiento estándares que garantizaron la seguridad del personal investigador así como la de la comunidad.