Análisis cromatográfico de los antibióticos betalactámicos

Una vez transcurrido el tiempo de almacenamiento en refrigeración y congelación para las diferentes alícuotas, las muestras se atemperaron o descongelaron en baño de agua a 25 ºC y se homogeneizaron correctamente. A continuación se procedió a la preparación específica de las muestras correspondientes a los procedimientos analíticos aplicados.

En los apartados posteriores se describe el procedimiento llevado a cabo para realizar la extracción y purificación de los analitos, las condiciones cromatográficas empleadas en el módulo de separación y las características del detector de masas específicas para cada una de las penicilinas y cefalosporinas estudiadas.

1.5.1.1. Extracción y purificación de las muestras

En un tubo de centrífuga de polipropileno de 40 mL se añadieron 10 ± 0,01 g de la muestra de leche fortificada previamente homogeneizada y se centrifugó durante 15 minutos a 10.000 r.p.m. A continuación se filtró el extracto sobrenadante a través de lana de vidrio y se recuperó el filtrado para purificarlo mediante el sistema de extracción (SPE).

Antes de proceder a la purificación del extracto, se acondicionó el cartucho SPE debidamente colocado en la unidad de filtración a vacío, pasando 1 mL de metanol seguido de 1 mL de agua ultra pura.

Inmediatamente y sin dejar secar la columna, se pasaron 2 mL de la muestra filtrada por gravedad, y en el caso de resultar necesario se conectó la bomba de vacío para regular la presión, sin que la velocidad de elución superase los 3 mL/min.

Una vez pasada toda la muestra se procedió al lavado de la columna con 2,5 mL de agua ultra pura y después se secó mediante vacío durante 10 segundos y bombeando aire con una jeringa de plástico conectada en la boca superior de la columna para eliminar el agua.

Seguidamente se colocó un tubo de vidrio previamente rotulado bajo la columna SPE y se eluyó el extracto con 2 mL de metanol. El eluato recuperado se evaporó hasta casi sequedad en el sistema de evaporación con corriente de nitrógeno (Turbo-VAP).

Finalmente se reconstituyó el eluato con 0,5 mL de fase móvil (ácido fórmico 0,1%) agitando durante 30 segundos. Después se mantuvo el tubo 5 minutos en ultrasonidos y con ayuda de una jeringa se filtró el colectado a través de un filtro de PVDF de 25 mm y 0,2 µm, en un microvial de 300 µL debidamente insertado en un vial cromatográfico de 2 mL para su análisis inmediato o refrigeración y congelación.

1.5.1.2. Separación y detección cromatográfica

El procedimiento empleado cada día de análisis para el estudio de las muestras de leche y sus correspondientes extractos, es el que se describe a continuación.

Tras la puesta en marcha, purgación manual y automática del equipo y estabilización total del sistema cromatográfico completo (sistema de separación y detector de masas), se insertó la tanda de muestras en el siguiente orden:

- Vial 1: Fase móvil

- Vial 2: Control negativo de la muestra

- Vial 3: Control positivo de penicilinas: muestra fortificada con las penicilinas estudiadas a las concentraciones equivalentes a sus LMR

- Vial 4: Control positivo de cefalosporinas: muestra fortificada con las cefalosporinas a las concentraciones equivalentes a sus LMR

- Vial 5: Patrón 1 de penicilinas (5 µg/kg): disolución de penicilinas en fase móvil con una concentración equivalente a 5 µg/kg

- Vial 6: Patrón 2 de penicilinas (10 µg/kg) - Vial 7: Patrón 3 de penicilinas (25 µg/kg) - Vial 8: Patrón 4 de penicilinas (50 µg/kg)

- Vial 9: Patrón 1 de cefalosporinas (30 µg/kg): disolución de cefalosporinas en fase móvil con una concentración equivalente a 30 µg/kg

- Vial 10: Patrón 2 de cefalosporinas (50 µg/kg) - Vial 11: Patrón 3 de cefalosporinas (80 µg/kg) - Vial 12: Patrón 4 de cefalosporinas (100 µg/kg) - Vial 13 y sucesivos: Muestras y extractos problema

El análisis del conjunto de muestras se programó y realizó mediante el Software MassLynx 4.0 (Waters) con las siguientes condiciones cromatográficas:

- Fase móvil en modo gradiente con las siguientes condiciones:

- Flujo de 0,6 mL/min

- Volumen de inyección de muestra de 20 µL

En cuanto al funcionamiento del espectrómetro de masas se utilizó la fuente de ionización por electrospray en modo positivo (ESI+), así como las condiciones de detección establecidas en el proceso de puesta a punto de la técnica para la identificación y cuantificación de los antibióticos betalactámicos.

En el Cuadro 18 se presentan las características de voltaje de cono y de colisión para la selección de los iones precursores y el fraccionamiento específico en los iones primarios y secundarios de las penicilinas y cefalosporinas estudiadas.

1.5.1.3. Interpretación de los cromatogramas

Para la identificación inequívoca de un antimicrobiano por espectroscopía de masas, la UE en la decisión 2002/657 establece unos criterios básicos que establecen la necesidad de establecer al menos 4 puntos de identificación. Teniendo en cuenta que la generación del ión precursor equivale a un punto de identificación y que cada

Tiempo (min) Bomba A (% ácido fórmico) Bomba B (%) 0-10 100 0 10-12 0 100 12-16 100 0

ión hijo equivale a 1,5 puntos, únicamente es necesario obtener dos iones hijo para poder identificar el analito estudiado.

Cuadro 18. Condiciones del espectrómetro de masas para la identificación y cuantificación de antibióticos betalactámicos

Antimicrobianos _(min) RT Ion precursor (m/z) Voltaje cono (V) Ion primario1 (m/z) Energía colisión (1/V) Ion secundario2 (m/z) Energía colisión (2/V) Ampicilina 7,30 350,3 20 105,9 15 160,1 15 Amoxicilina 3,34 366,3 18 114,0 20 208,0 13 Cloxacilina 11,29 436,3 22 160,2 10 277,3 10 Penicilina G 7,77 335,4 40 91,0 25 128,1 40 Cefalexina 7,30 348,2 15 106,2 30 157,9 20 Cefapirina 5,88 424,0 32 292,2 16 152,0 24 Cefquinoma 6,90 265,2 18 134,2 15 199,2 25 Cefoperazona 8,71 645,9 22 530,0 12 143,0 35

1 _{ión primario= ión hijo mayoritario= ión de cuantificación;} 2 _{ión secundario= ión hijo secundario= ión de confirmación}

Una vez verificados todos los parámetros de identificación (tiempo de retención, pesos moleculares de los iones precursores e hijos y energías de cono y colisión) así como la recuperación, linealidad y ajuste de la recta de calibrado, se procedió a la cuantificación de los analitos en estudio, a partir de los iones hijos mayoritarios formados.

Esta cuantificación se realizó integrando el área de los picos de los iones hijo mayoritarios en las rectas de calibrado de cada antibiótico betalactámico, obtenidas con anterioridad en la puesta a punto del método, y cuyos valores se exponen en el Cuadro 19.

Cuadro 19. Ecuaciones de las rectas de calibrado de los antibióticos betalactámicos Antimicrobianos Ecuaciones R2 CV (%) Amoxicilina y = 109,30·x - 11,70 0,9027 5,20 Ampicilina y = 22,01·x + 44,60 0,9504 2,37 Cloxacilina y = 71,67·x - 15,49 0,9024 6,55 Penicilina G y = 133,52·x + 38,46 0,9628 5,87 Cefalexina y = 779,36·x - 18,77 0,9852 4,66 Cefapirina y = 3145,61·x - 104,44 0,9993 5,01 Cefoperazona y = 1283,31·x - 230,11 0,9952 4,00 Cefquinoma y = 1103,20·x - 24.05 0,9655 5,12

A modo de ejemplo, en la Figura 21 se presenta el espectro del ión precursor de la cloxacilina obtenido a partir de una muestra de leche el primer día de refrigeración y en la Figura 22 los cromatogramas de los iones primarios y secundarios correspondientes obtenidos ese mismo día de análisis.

Figura 21. Espectro correspondiente al ión precursor de la cloxacilina en leche el primer día de refrigeración

Figura 22. Cromatogramas correspondientes a los iones primario y secundario de la cloxacilina en leche el primer día de refrigeración