GENERALIDADES

Los espectrómetros o detectores de masas (MS) trabajan pulverizando en primer lugar la muestra líquida en vapor e ionizando a continuación las moléculas de la muestra a su paso por una fuente de ionización, cargándolas positiva o negativamente. Dependiendo de las características de funcionamiento del espectrómetro (tipo analizador, voltajes de cono, campos electromagnéticos, etc.), los iones recién formados (precursores) se seleccionan directamente para identificar al analito o se fraccionan de una única forma en iones hijos, que son los que a continuación se seleccionan e identifican de acuerdo a la relación entre su masa y carga (m/z), y a partir de los cuales se cuantifica la cantidad de analito presente en la muestra.

Algunos de los componentes más importantes de un espectrómetro de masas son por lo tanto la fuente de ionización que genera los iones y por otro lado, el tipo de analizador que los selecciona, fracciona e identifica.

Existen diferentes tipos de fuentes de ionización (electroespray, ionización química a presión atmosférica, fotoionización a presión atmosférica, etc.) y distintos tipos de analizadores (cuadrupolo, trampa iónica, tiempo de vuelo, etc.) que se utilizan y combinan entre ellos dependiendo del compuesto que se pretende identificar y cuantificar.

Actualmente las técnicas más novedosas y potentes empleadas para la confirmación de la presencia de antimicrobianos en la leche y otras matrices alimentarias trabajan en “fase múltiple” más conocida como “tandem MS”, “MS/MS” o “MSn”.

Estas técnicas funcionan combinando varios analizadores dentro del espectrómetro y son capaces de seleccionar únicamente los iones precursores e hijos que se quieren analizar e identificarlos y cuantificarlos con elevada selectividad, sensibilidad y precisión.

Una de las técnicas más importantes utilizada hoy en día en la determinación y cuantificación de residuos de antimicrobianos en matrices alimentarias es el sistema LC con fuente de ionización por electrospray acoplada a espectrómetro de masas de tipo triple cuadrupolo (Daeseleire et al., 2000; Van Rhijn et al., 2002; Becker et al., 2004; Makeswara et al., 2005; Andersen et al., 2005; De Ruyck y de Rieder, 2007). El fundamento y funcionamiento general de esta técnica (LC-ESI-MS/MS) se describe en el apartado siguiente.

3.2.3.2. LC-ESI-MS/MS (triple cuadrupolo)

En este sistema cromatográfico el eluyente procedente de la columna del módulo de separación cromatográfica se inyecta directamente en el capilar de la cámara de la fuente de ionización por electrospray del espectrómetro de masas. En este capilar, la muestra se somete a un fuerte campo eléctrico que provoca su ionización, y al salir, la aplicación de nitrógeno a presión atmosférica hace que la muestra se nebulice en un spray de pequeñas gotas cargadas que contienen los compuestos ionizados.

A continuación se aplica un gas de desolvatación caliente, normalmente argon, para evaporar el solvente contenido en las gotas. Este proceso hace que las partículas reduzcan su tamaño y por lo tanto la densidad de cargas en su superficie aumenta, creando fuertes fuerzas de repulsión entre ellas (mayores que las de cohesión dentro de la propia gota) que producen la liberación en la fase gaseosa, de multitud de iones con una determinada relación masa/carga (m/z).

Los iones formados se dirigen hacia el cono de entrada del analizador del espectrómetro con la ayuda de la corriente de nitrógeno para ser analizados por el detector de masas. Una vez los iones entran en el sistema de detección, llegan al primer cuadrupolo donde se someten a un voltaje que crea un campo electromagnético que deja pasar únicamente aquellos iones con una relación m/z específica. Estos iones son los iones precursores también denominados iones padres o moleculares del analito que queremos identificar.

En la Figura 12 se presenta un esquema del funcionamiento de la fuente de ionización por electrospray.

Figura 12. Fuente de ionización por electrospary (ESI) Fuente: elaborado a partir de http://imaisd.usc.es

Gas nebulizador

Fuerte campo eléctrico

1. Formación de gotas cargadas 2. Evaporación Presión atmosférica Gas Gas Orificio Analizador de masas Liberación de iones Vacío

Los iones precursores que han atravesado la primera fase llegan al segundo cuadrupolo denominado celda de colisión. En esta celda se realiza la fragmentación de los iones precursores por colisión inducida al aplicar un gas y una energía de colisión que hacen que estos iones colisionen entre ellos y con partículas neutras y se fragmenten en iones hijos o producto.

Los iones hijos mayoritarios formados (hijos primarios) asociados a un determinado voltaje de colisión, son los que nos van a servir para cuantificar de forma inequívoca el analito analizado. Los iones hijos secundarios (hijos secundarios) son los que nos van a servir para confirmar la identidad del analito analizado.

El tercer cuadrupolo tiene la función de seleccionar los iones precursores, primarios y secundarios elegidos para el análisis y llevarlos hasta el detector para ofrecer el espectro de las masas (m/z) de los iones detectados. En la Figura 13 se muestra un esquema del funcionamiento general del espectómetro de masas triple cuadrupolo.

Figura 13. Espectrómetro de masas tipo triple cuadrupolo Fuente: elaborado a partir de http://www.library4science.com

El espectro de masas contiene las señales másicas correspondientes no solo al ión precursor sino también las relativas a los iones procedentes de la fragmentación o iones hijos (primarios y secundarios). La identificación del analito se realiza por un lado mediante el tiempo de retención (RT) que viene determinado por la separación cromatográfica y equivale al establecido en el calibrado del equipo (curva patrón), y por otro lado por la identificación en el detector basada en 4 características intrínsecas de cada molécula o analito empleado: peso molecular del ión precursor, voltaje de cono, energía de colisión y pesos moleculares de los iones hijo.

También se puede verificar la relación “ión ratio” existente entre los iones hijos formados en la fragmentación del ión precursor. Esta relación tiene unos valores diferentes en función de cada analito, que se obtienen en la fase de puesta a punto de la técnica. Cuadrupolo masas filtro Fuente ionización Cuadrupolo Celda colisión Cuadrupolo masas filtro Muestra Ionización Selección

ión precursor Fragmentación

Selección

iones hijos Detección

3.3. TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA PARA LA DETECCIÓN DE