Análisis de mutaciones somáticas en el gen kras

Se escogió este gen para analizar el daño oxidativo a partir del perfil de mutaciones somáticas porque en él se han descrito aumentos en la tasa de transversiones G>T asociados al déficit de proteínas reparadoras de la 8OHdG en tumores de pulmón en ratón [138], y más particularmente en tumores colorrectales humanos procedentes de pacientes con mutación bialélica en el gen MUTYH [139]. Se analizó el perfil de mutaciones en el gen KRAS en 40 tumores HNPCC-X y también en 17 tumores MUTYH de procedencia escocesa que nos sirven como controles positivos de inestabilidad genética debida al fallo en la reparación de 8OHdG.

En ninguno de los dos grupos de tumores analizados en este trabajo se observan mutaciones en el codón 600 del gen BRAF. Es lo esperado ya que mutaciones en este codón se asocian a tumores esporádicos con fenotipo metilador en islas CpG [140, 141]. Algunos autores encuentras mutaciones en BRAF analizando tumores HNPCC-MSS [62, 63] pero hay que señalar que la selección de tumores en estos dos estudios se realizó según unos criterios menos estrictos (criterios de Bethesda) lo que aumenta la heterogeneidad del grupo pudiendo incluir casos de cáncer no familiar. En otros dos estudios que analizan estas mutaciones en familias HNPCC-X seleccionadas según los criterios estrictos Amsterdam I y II [64, 142] no se encuentran mutaciones en BRAF en ninguno de los tumores analizados. Estos datos coinciden con nuestros resultados.

En cuanto a los resultados observados en la población MUTYH, de los 9 casos de tumores procedentes de pacientes con mutación bialélica y diagnóstico de MAP,

SUSCEPTIBILIDAD AL CÁNCER COLORRECTAL FAMILIAR NO POLIPÓSICO CON TUMORES ESTABLES A MICROSATÉLITES (HNPCC-X) D isc u sión 111 7 muestran un cambio G>T en el codón 12 de KRAS. Estos resultados coinciden con lo esperado ya que la carcinogénesis de estos pacientes es desencadenada precisamente por un aumento en la tasa de transversiones G>T que afecta frecuentemente a genes como APC y KRAS [28, 139]. En principio es llamativo que ninguno de los tumores con mutación monoalélica en el gen MUTYH presente mutaciones en KRAS, pero seguramente se deba al escaso número de muestras analizado (n=8).

Lo más sorprendente del análisis de mutaciones somáticas en el gen KRAS es la elevada tasa de mutaciones que se observa en nuestra población HNPCC-X (60%). Hay cuatro estudios que analizan la tasa de mutaciones somáticas en KRAS en distintas poblaciones de CCR hereditario y esporádico [62-64, 142].

Figura 38: Frecuencia (%) de mutaciones somáticas en KRAS en distintas poblaciones de CCR. Tasa de mutaciones teniendo en cuenta solo las 7 mutaciones más prevalentes en los codones 12 y 13.

Estos estudios muestran resultados dispares, pero ninguno encuentra una tasa de mutación superior al 40% (figura 38). Solo uno de ellos realiza el estudio en familias HNPCC-X seleccionadas con criterios estrictos Amsterdam [64] obteniendo un 32% de mutaciones. Estos autores solo analiza las mutaciones en

D

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112

los codones c.12 y c.13 de KRAS. La diferencia en los resultados, entonces, podría deberse a la inclusión de los exones 3 y 4 en nuestro estudio, pero el bajo número de mutaciones encontrados en tales exones no explica el gran aumento en la tasa de mutaciones KRAS en nuestra población (figura 38).

Atendiendo a la técnica empleada para la detección de mutaciones, tanto en nuestro estudio como en el de Goel [64] se ha utilizado secuenciación directa en todos los tumores. La búsqueda de mutaciones somáticas en DNA tumoral por secuenciación es un método poco sensible ya que va a depender de la pureza del DNA tumoral que tengamos y del porcentaje de células tumorales que sean portadoras de la mutación. Hay casos en los que es difícil decidir si una pequeña variación en el electroferograma se debe a una mutación en un pequeño porcentaje de células de nuestra muestra o sin embargo se debe a un artefacto de la técnica, por esta razón el análisis de mutaciones somáticas por secuenciación se vuelve subjetivo pudiendo dar lugar a interpretaciones diferentes y por tanto distintos resultados. Nosotros hemos confirmado todos aquellos casos dudosos por la técnica TheraScreen (DxS Ltd.) que consiste en la amplificación alelo específica mediante PCR a tiempo real de las mutaciones más prevalentes en KRAS, por lo que descartamos la presencia de falsos positivos.

Si analizamos el perfil de mutaciones en los tumores teniendo en cuenta solo los codones 12 y 13 (figura 39), nuestros resultados son similares a los encontrados en las poblaciones HNPCC-MSS descritas por Sánchez de Abajo [63] y Abdel- Rahman [62].

En relación al tipo de mutación, el porcentaje de cambios G>A en nuestros tumores HNPCC.X se asemeja a la población HNPCC-MSS de Sánchez de Abajo, a la población de CCR esporádico MSS descrita por Oliveira y también a los CCR esporádicos analizados en nuestro laboratorio (ESP-ESP-HCSC) (figura 39).

SUSCEPTIBILIDAD AL CÁNCER COLORRECTAL FAMILIAR NO POLIPÓSICO CON TUMORES ESTABLES A MICROSATÉLITES (HNPCC-X) D isc u sión 113 Figura 39: Tipos de mutaciones encontradas (%) en el gen KRAS en distintas

poblaciones de tumores CCR. Teniendo en cuenta solo las 7 mutaciones más prevalentes en los codones 12 y 13.

En relación al cambio G>T, que implica un daño oxidativo mayor, nuestros tumores HNPCC-X se asemeja a los HNPCC-MSS descritos [62, 63] mostrando un patrón intermedio entre los tumores esporádicos descritos por Oliveira [142] y los tumores HNPCC-MSI.