Análisis de transcritos en la variante OGG1-R46Q (c.137 G>A)

Debido a que el análisis de splicing in silico en la variante OGG1-R46Q mostró una probabilidad muy alta para la inactivación del donador de splicing en el exón 1 (donador e1), y a que previamente se ha descrito la inactivación parcial de esta diana en tejido tumoral homocigoto para esta variante dando lugar a tránscritos que retienen el intron 1 completo [96], se llevó a cabo un estudio de los tránscritos de OGG1 en cDNA de sangre periférica de portadores tal y como se describe en el apartado 3.2.2. del capítulo de Material y Métodos de esta tesis y se esquematiza en las figuras 15, 16 y 17. La amplificación selectiva del cDNA de portadores con cebadores situados entre los exones 1 y 4 muestra una banda cuyo tamaño se podría corresponder con el del trascrito normal (558 pb), y otra banda con un tamaño que podría coincidir con el del transcrito con retención del intrón 1 (1079 pb) (figura 23). Al secuenciar estas dos bandas específicamente en individuos portadores y no portadores, se confirma la secuencia correspondiente al transcrito normal y la correspondiente al transcrito con el intrón 1. La secuencia del transcrito normal no muestra el cambio c.137G>A en ningún caso, mientras que la secuencia correspondiente al transcrito con el intrón 1 es homocigota para el cambio en individuos portadores (figura

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23), lo que sugiere una inactivación total del donador e1 en el alelo mutado (c.137A). 600 500 1000 GGGG GGGAGAGA GG GGGGGG GG GGGA GG NEG cDNA DNAg S F Q X TCTTTCCAg t g a g t g act S F R W R E TCTTTCCGGTGGAGGGAG S F R W R E TCTTTCCGGTGGAGGGAG TCS F QTTTCCG g t Xg a g t g act NO PORTADORES (GG) PORTADORES (GA)

PCR1

a)

b)

Figura 23: Análisis por secuenciación de los transcritos de la variante OGG1- R46Q. PCR1: amplificación de transcritos de OGG1 entre los exones 1 y 4. En todos los casos se observa una banda intensa compatible con el tamaño del transcrito normal (tN) (558 pb). En portadores de la variante R46Q (GA) se observan bandas tenues de tamaño compatible con el transcrito esperado (1079 pb) en el caso de inactivación del donador de splicing e1 y retención del intrón 1 (tI1). Se amplificó DNA genómico como control negativo de esta PCR. Los genotipos se indican en amarillo. Marcador de peso molecular 1Kb (Biotools, B&M Labs) en la línea 1 y 100pb (GenSura Lab, Inc.) en la línea 2. a) Secuenciación de la banda tN: purificación de la banda correspondiente en portadores y no portadores. Secuenciación directa con un cebador reverso situado en el exón 2. En todos los casos el tN es homocigoto para el alelo silvestre (c.137G). b) Secuenciación de la banda tI1: secuenciación directa del producto de la PCR1 en portadores y no portadores con un cebador reverso situado en el intrón 1. Los portadores para la mutación muestran un tI1 homocigoto para el alelo mutado (c.137A).

SUSCEPTIBILIDAD AL CÁNCER COLORRECTAL FAMILIAR NO POLIPÓSICO CON TUMORES ESTABLES A MICROSATÉLITES (HNPCC-X) Result ad o s 79 tN tI1 NO PORTADORES (GG)

PCR externa

PCR

internas

a)

DIGESTIÓN tN

b)

600 500 1000 GGGG GGGAGAGAGG GGGGGGGG GGGA GG neg cDNA DNAg tI1 tN 500 GA GG GG g neg GA 200 GA GA GG 100 PORTADORES (GA) 104bp 482bp TRANSCRITO NORMAL

TRANSCRITO NORMAL DIGERIDO CON BSAWI

482bp

104bp

TRANSCRITO NORMAL

TRANSCRITO NORMAL DIGERIDO CON BSAWI

131bp 131bp

TRANSCRITO I1

TRANSCRITO I1 DIGERIDO CON BSAWI

104bp

131bp

TRANSCRITO I1

TRANSCRITO I1 DIGERIDO CON BSAWI

GA GG

GA

Figura 24: Análisis de restricción de los transcritos de la variante OGG1-R46Q. PCR externa (PCR1): amplificación de transcritos de OGG1 entre los exones 1 y 4. En todos los casos se observa una banda intensa compatible con el tamaño del transcrito normal (tN) (558 pb). En portadores de la variante R46Q (GA) se observan bandas tenues de tamaño compatible con el transcrito I1 (tI1) esperado en el caso de inactivación del donador de splicing e1 (1079 pb). Se amplificó DNA genómico como control negativo de cDNA. Los genotipos de cada muestra se indican en amarillo. Marcador de peso molecular de 1Kb (Biotools, B&M Labs) en la línea 1 y de 100pb (GenSura Lab, Inc.) en la línea 2.

PCR internas: amplificaciones a partir de los productos obtenidos en la PCR externa diluidos 500 veces. a) Se emplearon cebadores situados en los exones 1 y

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3 para amplificar el transcrito normal (tN) (482 pb). Los genotipos de cada muestra se indican en amarillo. Marcador de peso molecular 100pb (GenSura Lab, Inc.) en la línea 1. El análisis de restricción muestra una digestión prácticamente total de todo el transcrito tanto en portadores como en no portadores indicando que transcrito normal es homocigoto para el alelo silvestre (c.137G) en todos los casos. b) Se emplearon cebadores situados en el exón 1 e intrón 1 para así amplificar específicamente el transcrito con retención del intrón 1 (tI1). En todos los casos se obtuvo una banda intensa compatible con el tamaño esperado (131pb). Los genotipos de cada muestra se indican en amarillo. Marcador de peso molecular 100pb (GenSura Lab, Inc.) en la línea 1. El análisis de restricción muestra una falta total de digestión en el transcrito de los individuos portadores, indicando que el transcrito con retención del intrón 1 es homocigoto para el alelo mutado (c.137A) en portadores.

Se hizo un análisis de restricción de ambos transcritos para confirmar los resultados vistos por secuenciación. En este análisis se hicieron dos PCRs internas distintas a partir del producto de amplificación del cDNA de portadores y no portadores entre los exones 1 y 4 PCR externa) diluido 500 veces (figura 24).

Una de las PCR se hizo entre los exones 1 y 3, obteniendo así un producto de amplificación correspondiente al transcrito normal que tiene un tamaño óptimo para poder ser visualizado por electroforesis capilar (482 pb) (figura 24). Este producto se digirió con la enzima de restricción BsaWI y se visualizó de nuevo por electroforesis capilar. Como se puede observar en la figura 25a, tanto en los portadores de la variante R46Q como en los no portadores se observa una digestión total del transcrito indicando que en los portadores el transcrito normal procede enteramente del alelo silvestre (c.137G).

La segunda PCR interna se realizó entre el exón 1 y el intrón 1 para amplificar específicamente el transcrito que retiene el intrón 1. El producto de amplificación también tiene un tamaño acorde con el esperado y visualizable por electroforesis capilar (131 pb) (figura 24). Tras la incubación con BsaWI no se detecta digestión alguna del transcrito en pacientes portadores, indicando que todo el transcrito con intrón 1 detectado en portadores de la variante procede del alelo mutado (c.137A) (figura 24b). Cabe destacar que los no portadores también muestran la banda correspondiente al trascrito con retención del intrón 1 sugiriendo una inactivación parcial del donador e1 en el alelo silvestre (c.137G).

SUSCEPTIBILIDAD AL CÁNCER COLORRECTAL FAMILIAR NO POLIPÓSICO CON TUMORES ESTABLES A MICROSATÉLITES (HNPCC-X) Result ad o s 81 1.1.2. Análisis de variantes frecuentes

Las variantes con una frecuencia alélica superior al 10% fueron clasificadas como “variantes frecuentes”. Todas ellas cumplieron el equilibrio de Hardy- Weinberg en la población control.