III. MATERIALES Y MÉTODOS
III.4. ANÁLISIS DEL HAPLOTIPO ASOCIADO A LA MUTACIÓN C.3788_3790DELTCT
MUTACIÓN C.3788_3790DELTCT EN FANCA
III.4.1. Detección de la mutación c.3788_3790delTCT
Para la amplificación de la región del exón 38 donde se localiza la mutación c.3788_3790delTCT se usan los cebadores: 5’ GGGAGATGATGCTGAGTTGG 3’ y 5’ GTCTGGAAACCCTGACTTGG 3’, obteniendo un fragmento de 466pb. Se usa un programa de amplificación estándar, de 30 ciclos, con una temperatura de hibridación de 58ºC y un tiempo de extensión de 45seg. Para la reacción de amplificación, aproximadamente 0,25µg de ADN se mezclan con tampón de la polimerasa 1X,
0,125mM de dNTPs, 1,5mM de MgCl2, 1 unidad de polimerasa Taq, 0,25μM de cada
uno de los cebadores y se añade ddH2O hasta completar un volumen de 25µl por cada
reacción.
III.4.2. DHPLC para la detección de SNPs
Para la determinación del haplotipo asociado a la mutación c.3788_3790delTCT, se
analizan 10 SNPs altamente polimorficos localizados en el interior del gen FANCA,
Materiales y métodos
mediante la técnica de DHPLC, según descrita por Oefner y Underhill en 1995 (Yu et
al. 2006), y el sistema WAVE (Transgenomic). Brevemente, a partir de un fragmento
amplificado (150-500pb) que contiene el nucleótido de interés, se procede a la desnaturalización y renaturalización de la muestra para la formación de heterodúplexes y homodúplexes. La muestra es pasada a través de una columna que retiene el ADN y posteriormente se eluye despacio, pasando el eluído a través de un medidor de absorbancia. Para fragmentos del mismo tamaño, aquellos que contienen un apareamiento incorrecto fluyen a tiempos más cortos que los que forman un apareamiento perfecto. Así pues, si el individuo analizado es heterocigoto para el SNP, se espera un patrón de dos picos de absorbancia a tiempos distintos. Si el individuo es, en cambio, homocigoto, se espera obtener un solo pico, tal y como muestra la Figura 10. Para conocer el genotipo de los individuos homocigotos, se realiza una mezcla de cantidades equivalentes de ADN del individuo a estudiar y de un individuo control homocigoto de genotipo conocido y se repite el proceso, obteniendo un solo pico de absorbancia si paciente y control comparten genotipo, y dos picos si muestran genotipos distintos.
Figura 10. Ejemplo del resultado obtenido mediante el análisis de DHPLC del producto de amplificación del exón 18 de FANCA, en un individuo heterocigoto y un homocigoto para el SNP rs1800335.
Las amplificaciones de las regiones del gen que contienen los SNPs se realizan según las condiciones detalladas a continuación. En la Tabla 5 se muestran los cebadores utilizados para la amplificación de cada uno de los fragmentos.
Materiales y métodos _
Tabla 5. SNPs analizados para la determinación del haplotipo. Cebadores utilizados y tamaño del fragmento amplificado.
SNP Exón Posición Fragmento
(pb) Cebadores
rs1800285 6 c.596+74G/A 384 F: 5’GCCCAAAGGCCAGGGAGTTT 3’ R: 5’AGCCAGAAATCAAACCCGTCTGA 3’ rs1800286 8 c.710-12G/A 294 F: 5’CCCAAGCCATATGCTCACC 3’ R: 5’GGTACAAACAGCACGTTTCAA 3’ rs7190823 9 c.796G/A 189 F: 5’GCAGGTATCACACAAATTACAG 3’ R: 5’GCACAGTGAAACATACAGAGG 3’ rs2239359 16 c.1501G/A 247 F: 5’TGACTGTAAAGGGCTGTGTTTC 3’ R:5’GTGAGGAGTGGGCATGGA 3’ rs1800335 18 c.1715+82T/C 316 F: 5’GGCCTTCACTGCTCAGTCTT 3’ R: 5’TGGGACACATTCCAAAGAGC 3’ rs1800340 23 c.2151+8T/C 328 F: 5’AGCAGGATCCGTGGAATCGTAC 3’ R: 5’GAGAAGGCTCCATGCGTCTAATG 3’ rs7195066 26 c.2426G/A 444 F: 5’GAGGGCCAGGCTGCTACTT 3’ R: 5’GACAGATAAAATTCTGGAAGG 3’ rs1800345 33 c.3240-42 G/A 390 F:R: 5’GGCATTCCAGACACTGTTCC 3’ 5’GACACAGGCCAAGGCTCTG 3’ rs1061646 40 c.3935-16T/C 314 F: 5’CCAGCTGCTGACAGGTACC 3’ R: 5’GGACCCAGAAGTGCTGAGATG 3’ rs1800359 42 c.4260+29T/C 275 F:R: 5’GGCTCTGGCAGAAATAGTCG 3’ 5’GACTATGGGGGACACACCAG 3’
La amplificación de todos los productos se realiza en unas mismas condiciones: 0,25µg de ADN se mezclan con tampón de la polimerasa 1X, 0,125mM de dNTPs, 1,5mM de
MgCl2, 1 unidad de polimerasa Taq, 0,25μM de cada uno de los cebadores y se añade
ddH2O hasta completar un volumen de 50µl por cada reacción.
El programa de amplificación es el siguiente: - Desnaturalización: 94ºC, 4min.
-Touchdown (10 ciclos): Desnaturalización: 94ºC, 20seg.
Hibridación: 63ºC, 20 seg (-0,5ºC/ciclo) Extensión: 72ºC, 50seg.
-Amplificación (22 ciclos): Desnaturalización: 94ºC, 30seg. Hibridación: 58ºC, 30 seg Extensión: 72ºC, 50seg.
-Extensión: 72ºC, 5min.
Una vez amplificados los productos, se realiza la reacción de desnaturalización- renaturalización según el protocolo:
1. Se mezclan los productos amplificados de paciente y control, en caso necesario,
en una proporción 1:1, obteniendo un volumen de reacción de 10µl.
Materiales y métodos
2. Reacción de desnaturalización-renaturalización: 95ºC durante 5min, seguido de
enfriamiento progresivo, -1,4ºC/min, hasta una temperatura de 25ºC.
III.4.3. Análisis de microsatélites o VNTRs
Para la caracterización adicional del haplotipo, se analizan 4 microsatélites o VNTRs (del inglés, Número variable de repeticiones en tándem), localizados en zonas próximas al gen FANCA. Para el análisis de los VNTRs se amplifica un fragmento que contiene el VNTR mediante el uso de cebadores marcados con el fluorocromo 6-FAM. Posteriormente, se analiza el tamaño del fragmento amplificado mediante el secuenciador automático ABI3130XL, utilizando un marcador de peso molecular de 50 a 500pb marcado con el fluorocromo ROX. Los resultados son analizados mediante el programa informático GeneMapper. Los cebadores utilizados para la amplificación de cada uno de los microsatélites se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6. Cebadores y fragmento amplificado para el análisis de los VNTRs. VNTR *Dint. *Fragm.
(pb) Cebadores Referencia
d16s3026 CA 178-210 F: 5’CTCCCTGAGCAACAAACACC 3’ R: 5’GGTCATTTATATGCGCCTGA 3’ Base de datos UniSTS NCBI d16s3121 CA 79-85 F:R: 5’AGCTTTTATTTCCCAGGGGT 3’ 5’CATGTTGTACATCGTGATGC 3’ Base de datos UniSTS NCBI d16s3407 CA 195-205 F: 5’CCAACAATGCCAATTTCTAG 3’ R:5’CTCAGCCACACAGATAAAC 3’ (Whitmore1998) et al. d16s303 CA 101-121 F: 5’ GATCAGTGCTCGTTTTTTTTGGTTTGG 3’ R: 5’ CAACAAGAGCGAAACTCGGTCTCAA 3’ Base de datos UniSTS NCBI
*Dint. es dinucleótido y Fragm. es fragmento
Para la reacción de amplificación, aproximadamente 1µg de ADN se mezcla con
tampón de la polimerasa 1X, 0,125mM de dNTPs, 1,5mM de MgCl2, 1 unidad de
polimerasa Taq, 0,5μM de cada uno de los cebadores y se añade ddH2O hasta completar
un volumen de 25µl por cada reacción.
Para los VNTRs d16s3026, d16s3121 y d16s303, el programa de amplificación consiste en 30 ciclos de amplificación, con una temperatura de hibridación de 55ºC y un tiempo de extensión de 2min; mientras que para el d16s3407, se utilizan también 30 ciclos de amplificación, con una temperatura de extensión de 60ºC y 30seg de tiempo de extensión.
Materiales y métodos _