VARIABILIDAD EN LA SEVERIDAD DEL FENOTIPO CLÍNICO

Las bases moleculares que causan el fenotipo clínico de los pacientes de AF son aún hoy en día motivo de controversia entre la comunidad científica. La gran toxicidad de los ICLs en las células AF podrían explicar las deficiencias en la proliferación celular de los progenitores hematopoyéticos de la médula ósea, las malformaciones congénitas y la predisposición al cáncer, aunque queda por resolver el origen de los ICLs en las células de forma endógena El daño oxidativo, las disfunciones teloméricas o el estrés replicativo también podrían explicar una parte o la totalidad del fenotipo (Bogliolo et al. 2002). En este trabajo, se ha detectado una correlación positiva entre la sensibilidad al DEB y MMC y el número de malformaciones congénitas que presentan los pacientes de AF. Este dato indica que la incapacidad de reparar horquillas de replicación bloqueadas, y como consecuencia, la elevada apoptosis celular en fases del desarrollo embrionario, es con mucha probabilidad, la causa principal de las malformaciones observadas en los pacientes. Los genes implicados en la reparación del ADN parecen tener una función determinante durante el desarrollo embrionario, ya que las malformaciones congénitas son características de un elevado número de síndromes de inestabilidad cromosómica, como el síndrome de Cockayne, síndrome de Nijmegen o síndrome de Seckel (Hales

2005). Además, en el trabajo mostrado en el Anexo 3 (Raya et al. 2009), se pone de

manifiesto que la ausencia de la proteína FANCA compromete enormemente en la viabilidad de las células pluripotentes, probablemente, debido a un mayor control de la integridad del ADN celular en este tipo de células y a una propensión a la apoptosis en caso de detectarse un mínimo daño genético (Marion et al. 2009).

Discusión

Por otro lado, no se ha detectado correlación entre la sensibilidad celular a los ICLs y la edad de aparición del fallo medular. Las células progenitoras de la médula ósea son muy sensibles a citoquinas pro-apoptóticas expresadas en la médula en condiciones de estrés, por lo que su viabilidad podría estar regulada por otros factores paralelos a la reparación del ADN. Por tanto, los resultados obtenidos indican que la diversidad de síntomas observados en los pacientes de AF tiene desencadenantes distintos según el tipo de tejido, aunque la causa última, es decir la deficiencia en el gen FA, sea la misma.

La influencia del grupo de complementación en el número de malformaciones o la edad de aparición del fallo medular no ha podido ser analizado debido al bajo número de pacientes no FA-A de la población española, de los cuales se dispone de la información clínica. La correlación entre número de malformaciones y sensibilidad a los agentes inductores de ICLs indica que en aquellos grupos de complementación dónde se ha detectado una menor sensibilidad celular, se debería también apreciar un número menor de malformaciones. En nuestra población, el número medio de malformaciones de los pacientes FA-A es de 3,2, equivalente a los valores publicados en otros estudios (Faivre et al. 2000). En el estudio de asociación de marcadores genéticos asociados a severidad clínica realizada en 245 pacientes de diferentes países europeos, determinan que el grupo de pacientes FA-A es el que presenta menor número de malformaciones congénitas junto con FA-C, coincidiendo con los resultados obtenidos en este trabajo (Faivre et al. 2000).

No se ha detectado asociación entre el tipo de mutación en FANCA y los marcadores de

severidad clínica. Aunque en un estudio anterior se había detectado que los pacientes que presentan mutaciones truncadoras bialélicas presentaban fallo medular a una edad

más temprana (Faivre et al. 2000), este efecto no ha sido confirmado en el estudio

realizado en nuestra población, por lo que el tipo de mutación puede no tener valor pronóstico en cuanto a la determinación de la progresión de la enfermedad.

V.5. DETERMINACIÓN DE PROCESOS CELULARES

DESREGULADOS EN LAS CÉLULAS AF

El análisis de la variabilidad en el fenotipo clínico realizado en este estudio y también en otros estudios realizados en poblaciones con un mayor número de pacientes de AF 151

Discusión _

revela que la variabilidad dentro de los genes FA tiene poca repercusión en el fenotipo clínico de los pacientes. También hemos visto que el número de malformaciones congénitas parece estar directamente relacionado con la capacidad de reparación de los ICLs, pero no así la edad en la que aparece el fallo medular, por lo que las proteínas FA parecen estar implicadas en otros procesos celulares independientes de la reparación del daño, que podrían explicar parte del fenotipo clínico de los pacientes y plantear opciones para nuevas terapias. En este estudio se han detectado 90 proteínas desreguladas en las líneas FA, del total de 2500 proteínas que la técnica empleada nos permite detectada. De este dato se desprende que el defecto en un gen FA altera la expresión de hasta un 3,6% del total de proteínas expresadas en la célula. De estas 90, se han podido identificar 25 que muestran una expresión distinta en las líneas FA-A y/o FA-C deficientes con la misma línea revertida espontáneamente. Seis de ellas muestran una desregulación parecida en ambas líneas deficientes, por lo que podrían estar implicadas en procesos desregulados comunes en todos los pacientes de AF, pero la mayoría de proteínas se han detectado en solo uno de los subtipos indicando que existen diferencias importantes entre grupos de complementación. De las proteínas encontradas, dos de ellas: MX1 y HSPA1A han sido relacionadas con la AF anteriormente, validando así la metodología aplicada para detectar las diferencias de expresión. La mayoría de las proteínas encontradas presentan funciones conocidas en 5 procesos celulares concretos:

respuesta a inflamación (mediada por IFN-), metabolismo oxidativo, proteínas

mitocondriales, transporte vesicular o procesamiento del ARNm, indicando que las proteínas FA podrían participar en la regulación de estos procesos. La sobreproducción de la citoquina pro-apoptótica IFN- en las células AF es bien conocida (Dufour et al. 2003), por lo que muchas de las proteínas detectadas, como MX1, WARS o HYOU, están implicadas en la protección de la célula de los elevados niveles de IFN-. SET, por lo contrario, está implicado directamente en la producción de esta citoquina, por lo que

los niveles elevados de SET podrían ser la causa de la sobreproducción de IFN-. La

implicación de las proteínas FA en procesos de metabolismo oxidativo también ha sido apuntado anteriormente mediante la descripción de interacciones moleculares directas entre proteínas FA y proteínas implicadas en procesos de oxidación-reducción, como

NADPH citocromo P450 reductasa (Kruyt et al. 1998), GSTP1 (Cumming et al. 2001)

y CYP2E1 (Futaki et al. 2002). Tanto la sobreproducción de citoquinas pro-apoptóticas en la médula ósea de los pacientes, como la desregulación del metabolismo oxidativo

Discusión

153 celular pueden explicar parte del fenotipo observado en los pacientes. Las citoquinas pro-apoptoticas afectan la proliferación de las células madre hematopoyéticas que causa

el fallo medular (Dufour et al. 2003), por lo que se ha propuesto la utilización de

terapias basadas en la supresión de citoquinas como el TNF-α como método para

mitigar el fallo medular en los pacientes, aunque la utilización de este tipo de terapia, basada en la inhibición de la apoptosis, es discutida debido a que podría favorecer la

aparición del cáncer, como ocurre en el modelo murino doble deficiente en FANCD2 y

p53 (Houghtaling et al. 2005). De igual manera, el metabolismo oxidativo permite la

eliminación de xenobióticos que pueden causar daño en el ADN. El desequilibrio en procesos redox genera ROS en las células, las cuales, han sido directamente relacionado con el fallo medular (Smith 1996; Umegaki et al. 2001) y la diabetes mellitus tipo II

(Sheader et al. 2001; Vlassara y Palace 2002), frecuente en pacientes de AF. También

se han detectado varias proteínas mitocondriales desreguladas. La mitocondria interviene en el mantenimiento del equilibrio redox, por lo que las proteínas detectadas podrían tener relación también con el estado pro-oxidativo de las células AF. Finalmente, la relación entre las proteínas FA y las funciones de transporte vesicular y procesamiento de ARNm no ha sido hasta el momento investigada, aunque en un estudio de interacción mediante el sistema de doble híbrido, se identificaron varias proteínas con estas funciones interaccionando con las proteínas FANCA, FANCC o FANCG (Reuter et al. 2003). Nuestro estudio refuerza, por tanto, la implicación de las proteínas FA en estos procesos celulares. Además, las proteínas detectadas en este estudio pueden constituir posibles dianas terapéuticas para mitigar el fenotipo clínico, de un modo similar al que se ha observado reduciendo los niveles de oxígeno (Joenje et al. 1981) o inhibiendo la acción de TNF-α (Milsom et al. 2009).