4. Análisis metabolómico de plasma en pacientes con SCACEST vs controles
4.4. Análisis estadístico multivariante de plasma completo
Una vez completado el estudio de los 7 metabolitos identificados mediante huella dactilar, se llevó a cabo el análisis estadístico multivariante del conjunto de 69 metabolitos que fueron identificados en las muestras de plasma de pacientes con SCASEST y controles sanos (Tabla R_14).
En el análisis de componentes principales, se obtuvo una buena separación entre los grupos de pacientes con SCASEST y controles sanos tal y como se puede ver en el gráfico de observaciones de la Figura R_30 con una mayor dispersión en el grupo control (azul) que en los pacientes con SCASEST (rojo). Estableciendo una comparación con el gráfico de observaciones obtenido cuando se analizaron exclusivamente los 7 metabolitos obtenidos en la huella dactilar (Figura R_28), se puede apreciar que se produce una diversificación de los puntos al incluir todos los
150 metabolitos a estudiar aunque se mantiene una buena distinción entre grupos experimentales.
Figura R_30. Resultados del
análisis de componentes principales. El gráfico de observaciones muestra una buena separación de los grupos de estudio; controles sanos (azul) y pacientes con SCASEST (rojo). En la Figura R_31 se muestra el gráfico de variables donde se puede observar la diferente distribución de los metabolitos identificados. En los dos cuadrantes de la derecha se concentran los metabolitos que más influyen en la clasificación de los pacientes con SCASEST, es decir que se encuentran elevados en dicho grupo, y en los dos cuadrantes de la izquierda se concentran los metabolitos que más influyen en la clasificación de los controles sanos, es decir metabolitos que se encuentran disminuidos en los pacientes con SCASEST. El análisis estadístico empleando una t-Student al conjunto de áreas normalizadas de cada pico cromatográfico con respecto al estándar interno en el grupo de controles sanos y de pacientes SCASEST dio como resultado la existencia de 15 metabolitos (alanina, ácido 2-ceto-3-metilvalérico, serina, leucina, treonina, glicina, ácido 2-OH-benzoico, ácido palmítico, ácido linoleico, ácido cis- vaccenico, lactato, ácido alfa-OH-valérico, citrato, 5-oxo-prolina y ácido esteárico) cuyas área de pico normalizadas presentaban variaciones estadísticamente significativa entre ambos grupos. De ellos, 8 metabolitos (ácido 2-OH-benzoico, ácido palmítico, citrato, ácido cis-vaccenico, lactato, ácido alfa-OH-valérico, 5-oxo-prolina y ácido esteárico) se encontraron elevados en el grupo de pacientes SCASEST y 7 metabolitos (alanina, ácido 2-ceto-3-metilvalérico, serina, leucina, treonina, glicina y ácido
151 linoleico) presentaban una disminución estadísticamente significativa en el mismo grupo (Tabla R_15).
Figura R_31. Resultados del análisis de componentes principales para el análisis completo de plasma. El
gráfico de contribución muestra la distribución de los 69 metabolitos identificados.
Tabla R_15. El análisis t-Student reveló la existencia de 7 metabolitos significativamente disminuidos en
pacientes con SCASEST (izquierda) y 8 metabolitos significativamente aumentados (derecha). En el caso de los aminoácidos se sumaron las áreas normalizadas de las fracciones libres (ej. Serina (COOH)) y derivatizada (ej. Serina (COO-SiMe3)) para su análisis estadístico.
Como era esperado, los 7 metabolitos que se encontraron estadísticamente alterados en el análisis previo mediante huella dactilar (alanina, serina, treonina, glicina, ácido 2-
Metabolito t Sig.
(bilateral) Metabolito t
Sig. (bilateral) Alanina 5,890 <0,001 Ácido 2-OH-benzoico -11,570 <0,001 Treonina 5,727 <0,001 Citrato -5,667 <0,001 Serina 5,163 <0,001 Ácido palmítico -3,660 0,002 Glicina 5,040 <0,001 Ácido cis-vaccenico -3,140 0,009 Ácido 2-ceto-3-metilvalérico 3,805 0,002 Ácido alfa-OH-Valérico -2,868 0,010 Leucina 2,719 0,014 Ácido esteárico -2,809 0,012 Ácido linoléico 2,708 0,014 Lactato -2,623 0,017 5-oxo-prolina -2,111 0,049
152 ceto-3-metilvalérico, ácido 2-OH-benzoico y ácido palmítico) también lo estaban en el análisis metabolómico completo del plasma.
Figura R_32. Resultados del análisis de agrupamiento jerárquico. El análisis de disimilitud utilizando el
método de Ward muestra una distancia entre componentes del mismo grupo mayor (<3) que la observada en el estudio de huella dactilar (<0.02).
El análisis de agrupamiento jerárquico en el caso del estudio metabolómico de los 69 metabolitos (Figura R_32) mostró una peor clasificación de ambos grupos experimentales tanto en el estudio de disimilitud (derecha) como en el estudio de similitud (izquierda) que en el caso del análisis de los 7 metabolitos identificados mediante huella dactilar (Figura R_29). En este caso, la distancia entre componentes de un mismo grupo es mayor (<3) que la observada en el estudio por huella dactilar (<0.02). Se observa también que a diferencia de lo ocurrido en el estudio por huella dactilar, la clasificación de las muestras en los dos grupos experimentales es peor lo que de nuevo pone de manifiesto la diferencia altamente significativa en los perfiles plasmáticos de los 7 metabolitos diferenciales observados mediante huella dactilar entre controles sanos y pacientes con SCASEST.
En la Tabla R_16 se recoge una breve descripción de la función biológica referida en la base de datos metabolómica humana (Human metabolomic database, HMDB) para cada uno de los 15 metabolitos que se encontraron alterados en el análisis metabolómicos completo de plasma en pacientes con SCASEST frente a controles sanos.
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Tabla R_16. Breve descripción de la función biológica de los metabolitos que se encontraron alterados
en pacientes con SCASEST frente a los controles sanos.
Metabolito Función biológica
Alanina Aminoácido no esencial que presenta altas concentraciones en el músculo y cuya funciona principal es el aporte de energíal. Actúa como regulador en el metabolismo de la glucosa. Los niveles sanguíneos de alanina se regulan paralelamente a los niveles de azúcar en la sangre en la diabetes y la hipoglucemia de modo que la alanina reduce tanto la hipoglucemia severa como la cetosis de la diabetes. Es un aminoácido importante para la reproducción de linfocitos y la inmunidad.
Treonina Aminoácido esencial en los seres humanos. Es abundante en el plasma humano, sobre todo en los recién nacidos. Es un inmunoestimulante que promueve el crecimiento de la glándula del timo. Probablemente también puede promover la función de las células de defensa inmunitaria.
Serina La serina y los productos de su metabolismo han sido reconocidos no sólo por ser esenciales para la proliferación celular, sino también para las funciones específicas en el sistema nervioso central. Los resultados de los niveles alterados de la serina y la glicina en pacientes con trastornos psiquiátricos y las anormalidades severas neurológicas en pacientes con defectos de la síntesis de L-serina da relieve la importancia de la L-serina en el desarrollo y función del cerebro.
Glicina La función principal de la glicina es como un precursor de las proteínas. También es un bloque de construcción para numerosos productos naturales. La glicina es un neurotransmisor inhibidor en el sistema nervioso central, especialmente en la médula espinal, tronco cerebral, y la retina. Cuando los receptores de glicina se activan, el cloruro entra en la neurona a través de receptores ionotrópicos, causando un potencial postsináptico inhibidor. Ácido 2-ceto-3-metilvalérico Metabolito de la isoleucina utilizado como marcador urinario de la enfermedad de jarabe de arce, una enfermedad
genética causada por una deficiencia en la actividad del complejo de la deshidrogenasa de alfa-cetoácidos de cadena ramificada lo que impide metabolizar los aminoácidos leucina, isoleucina y valina, lo cual lleva a una acumulación de estos químicos en la sangre
Leucina Junto con la valina e isoleucina constituyen los tres aminoácidos esenciales de cadena ramificada. A pesar de sus semejanzas estructurales, los aminoácidos ramificados tienen diferentes rutas metabólicas, la valina es glucogénica, la leucina es exclusivamente cetogénica y la isoleucina ambos.
Ácido linoléico El ácido linoleico es un ácido graso insaturado también conocido como un ácido graso omega-6. Es un ácido graso esencial en la nutrición humana, ya que no pueden ser sintetizados por los seres humanos. Se utiliza en la biosíntesis de las prostaglandinas a través de ácido araquidónico y las membranas celulares.
Ácido 2-OH-benzoico El ácido salicílico o salicilato, es el principal producto metabólico de la del ácido acetilsalicílico, fármaco usado frecuentemente como antiinflamatorio, analgésico, antipirético y antiagregante plaquetario indicado para personas con riesgo de formación de trombos sanguíneos.
Citrato Ácido débil que se forma en el ciclo de Krebs o que puede ser introducido con la dieta. La evaluación de niveles plasmáticos de ácido cítrico apenas se utilizan en el diagnóstico de enfermedades humanas. Por el contrario, la excreción urinaria de citrato es una herramienta común en el diagnóstico diferencial de los cálculos renales, acidosis tubular renal y que desempeña también un papel en las enfermedades óseas.
Ácido palmítico El ácido palmítico o ácido hexadecanoico es uno de los más comunes los ácidos grasos saturados que se encuentran en animales y plantas, un ácido graso saturado que se encuentra en las grasas y ceras incluyendo aceite de oliva, aceite de palma, y los lípidos del cuerpo.
Ácido cis-vaccenico Presente en todos los tejidos y en casi todas las clases de lípidos a una concentración baja.
Ácido palmitoleico Ácido graso insaturado constituyente común de los glicéridos de tejido adiposo humano. Presente en todos los tejidos, generalmente se encuentra en mayores concentraciones en el hígado.
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