Principales plataformas de análisis metabolómico

4.3.1. Resonancia magnética nuclear

La resonancia magnética nuclear (RMN) es una técnica de análisis espectroscópico en la que los núcleos atómicos de los compuestos a estudiar se alinean gracias a la aplicación de un campo magnético constante para posteriormente perturbar este alineamiento con el uso de un campo magnético alterno, de orientación ortogonal. El espectro de RMN resultante es una colección de picos a posiciones e intensidades diferentes y características de cada compuesto que permiten su identificación [156]. Entre las ventajas que presenta la RMN se encuentran su capacidad para detectar múltiples metabolitos en un solo experimento [157], el tratarse de una técnica que no destruye la muestra durante el análisis, a diferencia de la espectrometría de masas (MS), y que no requiere preparación previa de la muestra. Permite además, obtener información estructural que puede facilitar la identificación de un metabolito desconocido. Como desventajas de esta técnica figuran su baja sensibilidad y resolución

55 espectral, lo que supone su escasa capacidad para determinar metabolitos que se encuentran en baja concentración, lo que le ha restado interés para su aplicación en experimentos metabolómicos frente a las técnicas basadas en MS [158].

4.3.2. Cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC-MS)

La cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS), empleando una ionización por electrospray (ESI) como fuente de ionización, constituye la plataforma más utilizada en la actualidad para el análisis metabolómico [159, 160]. Su popularidad se debe a su gran versatilidad, que permite el análisis de una amplia variedad de moléculas. Además, a diferencia de los que ocurre con la cromatografía de gases (GC), no es necesaria la volatilidad de la muestra por lo que su derivatización previa al análisis no es necesaria disminuyendo de esta manera las pérdidas de muestra secundarias a su pre-tratamiento. Los equipos LC-MS permiten una mayor cobertura de metabolitos, atendiendo a sus distintas características físico-químicas que los equipos de GC-MS (Figura I_11). Recientemente, se ha desarrollado un nuevo tipo de LC llamado cromatografía hidrofílica de interacción (HILIC) que permite analizar los compuestos polares no analizables mediante la LC convencional [161]. A pesar de sus ventajas, HILIC tiene claras desventajas que incluyen una mala reproducibilidad, con variación en los tiempos de retención cuando se analizan múltiples muestras. El amplio rango de características físico-químicas de los metabolitos que pueden analizarse mediante LC ha hecho que surjan alternativas específicas para compuestos de determinada naturaleza como es el caso de la ionización química dinámica (APCI) para los compuestos no polares tales como lípidos. Los analizadores más comunes que se utilizan en los estudios metabolómicos son el cuadrupolo, la trampa iónica y el analizador de tiempo de vuelo (TOF). Otros tipos de analizadores que se pueden emplear son orbitrap, la resonancia ciclotrónica de iones con transformada de Fourier (FT-ICR) y el triple cuadrupolo (QQQ).

4.3.3. Cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC-MS)

La cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) es una plataforma de uso común en la metabolómica y constituye una excelente elección para el análisis de compuestos volátiles tales como ácidos grasos y ácidos orgánicos. Debido a que la separación en GC se produce en función de sus diferentes puntos de ebullición, es necesario que los metabolitos a separar sean volátiles y estables térmicamente. En la mayoría de los casos, el conjunto de metabolitos presentes en una muestra no va a

56 cumplir estas condiciones por lo que es necesario realizar la derivatización previa de la muestra antes del análisis. Entre los reactivos de derivatización más utilizados se encuentran el BSTFA (N,O-Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida) y el MSTFA (N-metil- (trimetilsilil)trifluoroacetamida) [149, 162-165]. La reacción de derivatización es un paso que puede dar lugar la formación de productos secundarios que darán lugar a análisis cualitativos y cuantitativos erróneos. Por ejemplo, en el caso de los monosacáridos la derivatización conduce a múltiples picos perteneciente a cada compuesto individual del azúcar. Esto se evita mediante la introducción de un paso previo de oximación antes de sililación, que disminuye el número de picos obtenidos para cada monosacárido. A diferencia de lo que ocurre cuando se emplea LC-MS, la introducción de un paso de pre-tratamiento previo de la muestra puede resultar en la pérdida de parte de la muestra lo que constituye la principal desventaja de GC-MS. Una de las más aspectos útiles cuando se usa la GC-MS para los estudios metabolómicos es la existencia de bibliotecas de espectros de masas que facilitan la labor de identificación de los metabolitos que componen la mezcla. La GC posee, además, un poder de resolución mucho mayor que la LC con tiempos de retención más robustos y reproducibles. Sin embargo, GC-MS tiene rango de masa limitada y el ion molecular a menudo no se detecta debido a la fragmentación, lo que dificulta la identificación de compuestos desconocidos. Recientemente, han surgido estrategias alternativas para mejorar la separación y la sensibilidad de mezclas complejas de metabolitos como los cromatógrafos de gases bidimensionales GCxGC, que separan las muestras complejas, desviando cada metabolito de una primera columna de CG a un segunda columna GC.