8.4 Análisis fenotípico de la cepa reintegrante

El análisis fenotípico del mutante nulo en el gen CWT1 mostró, entre otras

alteraciones, que la cepa 3AH presentaba hipersensibilidad a ciertos compuestos que interfieren el correcto ensamblaje de los componentes de la pared celular respecto de la cepa parental (ver sección IV.7.6). Además el mutante heterocigótico 3A era más resistente al antifúngico quetoconazol que las cepas parental y mutante nulo (ver sección IV.7.5). Estas características fenotípicas fueron utilizadas para estudiar el

fenotipo de la cepa reintegrante 3BICWT1. Esta cepa que expresa el gen CWT1 bajo el

control del promotor de CaPCK1 debería perder la hipersensibilidad por estos

compuestos en caso de que el fenotipo observado en el mutante nulo fuera debido exclusivamente a la delección de este gen.

Para llevar a cabo este estudio, se realizaron pruebas de sensibilidad a calcofluor white, rojo Congo y quetoconazol. Puesto que las cepas 3BI y 3BICWT1 no presentaban ninguna auxotrofía, la comparación se realizó con las cepas CAI4-URA, 3A-HISURA y 3AH-URA para anular un posible efecto causado por las diferencias en el fondo genético de las cepas utilizadas. Cultivos de las distintas cepas creciendo en

los medios de represión e inducción se ajustaron a D.O600nm 1 y gotas 3 μl de

diluciones seriadas fueron depositadas en placas con los medios de inducción (SCAA) y represión (SD + 4% glucosa) y conteniendo calcofluor white (0-20 μg/ml), rojo Congo (0-5 μg/ml) o quetoconazol (0-0.5 μg/ml).

La sobre-expresión del gen CWT1 en el mutante nulo produjo la pérdida de

hipersensibilidad observada anteriormente por calcofluor white o rojo Congo (ver Fig. IV.17), ya que la cepa sobre-expresante (3BICWT1) se comportó de la misma manera que la cepa parental (CAI4-URA) en presencia de estos compuestos que alteran la arquitectura de la pared celular (Fig. IV.30).

Se estudió también la sensibilidad de la cepa 3BICWT1 a quetoconazol, ya que se había observado que el mutante homocigótico, y en mayor medida el mutante heterocigótico, eran menos sensibles a la acción de este antifúngico que la cepa

parental (ver Fig. IV.15), la cepa que sobre-expresa el gen CWT1 presentó la misma

Los resultados obtenidos con este experimento demostraron que los efectos

fenotípicos observados tras seleccionar uno o los dos alelos del gen CWT1 eran

debidos a la ausencia de este gen y no a cualquier otro efecto producido en la célula,

ya que la reintegración y sobre-expresión de CWT1 bajo el control del promotor del

gen CaPCK1 en el mutante nulo produjo la recuperación del fenotipo original

observado para la cepa parental (Fig. IV.30).

Figura IV.30- Análisis fenotípico de la cepa sobre-expresante de CWT1. Para demostrar que los

efectos fenotípicos observados en el mutante nulo eran debidos a la disrupción de CWT1 se reintegró el

gen en la cepa mutante bajo el control de un promotor inducible y se realizaron pruebas de sensibilidad a sustancias como CFW y RC para las que la cepa mutante es hipersensible. Para analizar el efecto de estas sustancias sobre las distintas cepas se obtuvieron cultivos en condiciones de represión e inducción del

promotor, se ajustaron a D.O600nm 1 y se realizaron diluciones decimales seriadas. Se gotearon 3 μl de

cada dilución en placas de los medios correspondientes que contenían CFW (0-20 mg/ml) y RC (0-5

mg/ml) y se incubaron 48 h a 28ºC. La sobre-expresión de CWT1 en la cepa mutante producía la

recuperación del fenotipo original de la cepa parental.

IV.9- ANÁLISIS DEL PERFIL TRANSCRIPCIONAL DEL MUTANTE NULO

cwt1Δ/cwt1Δ

A la vista de las múltiples alteraciones que reveló el estudio fenotípico del

mutante nulo en el gen CWT1 se puede deducir que un factor de transcripción puede

regular simultáneamente diversos de genes (activando o reprimiendo su expresión) que estén involucrados en distintas funciones celulares.

Con el fin de estudiar la expresión global de los genes de C. albicans en

respuesta a la interrupción del gen CWT1, se realizó un estudio del transcriptoma del

mutante nulo (cepa 3AH) utilizando micromatrices de ADN específicas de C. albicans.

Las micromatrices de ADN (Fig. IV.31) fueron fabricadas por la empresa Eurogentec S.A. (Ivoz- Ramet, Belgium) en colaboración con el Consorcio Europeo Galar Fungail, proyecto en el cual participo nuestro grupo de investigación. En la fabricación de las micromatrices se utilizaron oligonucleótidos específicos

de las 6039 ORFs del genoma de C.

albicans para amplificar sondas, de un

tamaño aproximado de 300 pb, correspondientes a cada uno de los genes.

Fig IV.31- Imagen de una de las micromatrices de ADN utilizadas para el estudio transcripcional de los mutantes en el gen CWT1.

Las 6039 sondas obtenidas, así como otros amplicones utilizados como controles se encuentran inmovilizados por duplicado en el soporte de la micromatriz.

Se realizaron micromatrices comparativas utilizando las cepas CNC43 y 3AH

crecidas en medio YPD tanto en fase exponencial de crecimiento (D.O600nm=0.5) como

en fase estacionaria (D.O600nm=9). Para cada condición de estudio se realizaron tres

micromatrices con la finalidad de obtener resultados estadísticamente significativos. Además, en cada experimento se realizó un cambio de fluoróforo para normalizar las posibles diferencias en la eficiencia de emisión de ambos fluoróforos. La metodología utilizada, normalización de datos y análisis estadísticos seguidos en este experimento se describen en el capítulo de Materiales y Métodos (ver sección III.15).

IV.9.1- Perfil transcripcional del mutante nulo cwt1Δ/cwt1Δ en fase exponencial