Análisis genético

Las células extraídas son el objeto del estudio genético, representativas del resto del embrión. En principio, cualquier enfermedad causada por una mutación en un gen conocido puede ser diagnosticada en célula única, con el hándicap de que solo disponemos de una o dos células para realizar el diagnóstico.

Además las técnicas que se utilizan en el análisis genético deben permitir un diagnóstico muy rápido y preciso, compatible con el período máximo que los preembriones se mantienen viables en cultivo in vitro, es decir 5-6 días después de la recuperación de los ovocitos. En el caso de que no se disponga del resultado genético a tiempo, los embriones se tienen que congelar programándose posteriormente su transferencia en un ciclo de transferencia de embriones congelados (TEC), una vez se disponga del resultado.

Las técnicas empleadas para el análisis de célula única, proceden de la citogenética básica y la biología molecular. La dificultad reside en adaptar los protocolos existentes para las distintas enfermedades a la circunstancia de disponer solo de una célula.

Las dos técnicas básicas utilizadas son dos:

a) La Hibridación in situ fluorescente (FISH, Fluorescent in situ Hybridyzation). La técnica FISH es una técnica que permite detectar la

localización de secuencias de ADN conocidas en los cromosomas. Utiliza sondas fluorescentes que se unen específicamente a las regiones del cromosoma cuya secuencia es complementaria. Utilizando

microscopía fluorescente se pueden visualizar los puntos de unión entre la sonda y el cromosoma.

La FISH conlleva tres fases:

1. Fijación del núcleo en un portaobjetos.

Para fijar el núcleo existen tres métodos descritos (Velilla et al., 2002):

- _{Acido acético/metanol (Carnoy) (Tarkowsky et al., 1966, modificado}

por Munné et al.,1998)

- _{Tween 20HCL (Coonen et al., 1994)}

- _{Tween 20HCL y ácido acético/metanol (Dozortsev and McGinnis.,}

2001)

Se basan en la lisis celular y liberación del núcleo de los restos citoplasmáticos, que queda fijado en un portaobjetos.

2. Hibridación.

Esta fase conlleva una desnaturalización previa de la doble cadena del núcleo ya fijado y de las sondas específicas marcadas (según los cromosomas que queremos analizar), para una posterior hibridación de la sonda con su secuencia complementaria, en condiciones de humedad y temperatura controladas.

3. Análisis bajo microscopio de fluorescencia. Una célula euploide presenta 2 señales para cada cromosoma (excepto para el cromosoma X e Y según el sexo).

CEP XX/18x2

CEP X/Y/18x2

LSI 13x2/21x3

La FISH se emplea para screening de aneuploidias en el PGS, para determinación de sexo en enfermedades hereditarias ligadas al cromosoma X y para el estudio de anomalías cromosómicas estructurales.

Esta técnica tiene varias aplicaciones para análisis preimplantacional:

- _{Por una parte, y tal y como se ha comentado previamente, se aplicaba}

al PGS para parejas procedentes de ciclos de fecundación in vitro de mal pronóstico. Se recomienda el análisis de los cromosomas más frecuentemente implicados en cromosomopatías viables y abortos de primer trimestre (cromosomas 13, 16, 18, 21, 22, X e Y). Además se aconseja incluir el estudio de otros cromosomas en función de cada indicación. No obstante, para esta indicación en particular, la FISH en la actualidad ha quedado desbancada por tecnología más eficiente y completa como la CGH.

- _{También se ha utilizado para el PGD de enfermedades ligadas al}

utilizar sondas específicas del cromosoma X y del cromosoma Y, marcadas con diferentes fluorocromos, cuya visualización al microscopio es fácil de interpretar. No obstante, actualmente en la inmensa mayoría de los laboratorios se ha preferido sustituir esta técnica por el sexado mediante PCR, o por protocolos específicos directos y/o indirectos para determinar el estatus de embriones sanos, portadores o afectos de la enfermedad.

- _{Por último, también se puede utilizar FISH para la detección de}

anomalías cromosómicas estructurales y de aneuploidías. El ejemplo más claro es el de parejas, en las que uno de los dos miembros es portador de una translocación cromosómica equilibrada, que puede transmitir en desequilibrio a su descendencia. El caso más representativo puede ser el de una translocación robertsoniana entre dos cromosomas acrocéntricos (13, 14, 15, 21 y 22) o la translocación cromosómica recíproca más frecuente entre un cromosoma 11 y un cromosoma 22.

b) La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction). Se trata de una técnica de clonación in vitro que permite

obtener un elevado número de copias de una o varias regiones concretas de interés del genoma. Hoy por hoy, la inmensa mayoría de los procedimientos de diagnóstico molecular aplicado al PGD de enfermedades monogénicas requieren aislamiento de blastómera, lisis celular, y técnicas fundamentalmente basadas en PCR para análisis molecular directo y/o indirecto.

Para llevar a cabo la amplificación de un fragmento específico de ADN es necesario conocer las secuencias flanqueantes a la región de interés, las cuales nos van a aportar la información necesaria para el diseño de los cebadores o primers. Dichos cebadores son secuencias cortas de ADN de unas 15 a 30 bases complementarias a cada una de las cadenas de la región que se quiere amplificar. También son necesarios los desoxinucleótidos trifosfato, dATP, dCTP, dGTP y dTTP, que actúan como precursores del ADN, así como una ADN polimerasa, que es la enzima que sintetiza las nuevas copias del fragmento de ADN de interés. La PCR se desarrolla normalmente en tres pasos:

- Desnaturalización: esta fase se realiza a 94ºC-96ºC y consiste en la separación de la doble cadena de ADN.

- Hibridación: fase en la que los cebadores o primers se unen a su molde. La temperatura de hibridación es específica de cada fragmento y de los cebadores empleados.

- Extensión: esta fase se realiza a 72ºC y en ella la enzima ADN polimerasa incorpora los desoxinucleótidos disponibles en el medio y extiende la hebra que se está sintetizando.

Un esquema general de una reacción de PCR es el siguiente, aunque siempre hay modificaciones de la técnica que se pueden realizar:

94-96ºC 5min Desnaturalización Inicial Ciclos de amplificación N T e m p e ra tu ra Tiempo Desnaturalización 94-96ºC 30-60s Hibridación 53-68ºC 30-60s Extensión 72ºC 30-60s Extensión Final 72ºC 7-10min Tiempo T e m p e ra tu ra