Análisis microbiológico 24

5.4.1. Evaluación de la precisión del conteo directo con DAPI y conteo en placa

5.4.1.1. Curva patrón de Escherichia coli

Para realizar el preinóculo de la curva patrón se tomó una colonia a partir de un cultivo de 24 h en agar nutritivo (Pronadisa) de E. coli (CMDMPUJ034) y se inoculó en 50 mL de caldo nutritivo (Pronadisa) contenidos en un erlenmeyer de 250 mL, el cual se llevó a incubación durante 12 h a 160 rpm y 30±2ºC. Después de la incubación, 5 mL del preinóculo fueron transferidos en condiciones asépticas a 45 mL de caldo nutritivo contenidos en un erlenmeyer de 250 mL y se dejó nuevamente en incubación durante 12 h a 160 rpm y 30±2ºC. Para llevar a cabo la curva patrón en caldo nutritivo se agregó el inóculo al 10% conservando una relación de 1:5 medio:recipiente y se incubó durante 2.5 h a las mismas condiciones del preinóculo e inóculo. Se tomaron muestras cada media hora desde la hora 0 para un total de 6 muestreos. Durante la curva no se retiró más del 10% del volumen efectivo de trabajo. Se determinó la absorbancia (540 nm) por duplicado y las unidades formadoras de colonia (UFC)/mL en agar nutritivo por triplicado en cada uno de los muestreos.

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5.4.1.2. Precisión de la técnica de conteo directo con DAPI y conteo en placa utilizando un cultivo de E. coli

Para determinar la precisión de la técnica de conteo directo utilizando DAPI se prepararon diferentes soluciones de E. coli a partir de un cultivo puro en fase exponencial llevado a cabo a las mismas condiciones de la curva patrón, el cual se diluyó con base 10 en solución salina 0.85% (p/v). A cada solución se le realizó conteo directo con DAPI y conteo en placa en agar nutritivo por triplicado.

5.4.2. Procesamiento de las muestras

La extracción de los microorganismos de la matriz del suelo se realizó según la metodología desarrolla por Latorre (2007). Para esto se tomaron 10 g de muestra y se adicionaron a 90 mL de solución salina 0.85% (p/v) (Merck) filtrada (0.22 µm) y estéril, y se llevaron a agitación orbital (InnovaTM 2100) a 160 rpm por 15 min. Pasado este tiempo se dejó sedimentar durante 5 min, y en condiciones de esterilidad se realizaron diluciones seriadas con base 10 hasta 10-5, homogenizando entre cada dilución en un vortex (Barnstead/thermolyne M-37615).

Los datos obtenidos durante el conteo de microorganismos totales con DAPI y el conteo de heterótrofos de las muestras de suelo se convirtieron a gramos de peso seco (gps) dividiendo el dato por la fracción de peso seco de cada una de las muestras.

5.4.2.1. Conteo total de células con 4-6 diamidino-2-fenilindol (DAPI)

Para este procedimiento se siguió el protocolo de la técnica de conteo directo con DAPI en el microscopio Nikon Eclipse 5.0i, estandarizada por Vela (2007). Se tomó 1 mL de la dilución 10-3 la cual se lavó dos veces con solución salina 0.85% (p/v) filtrada (0.22 µm) y estéril a 13,000 rpm por 5 min. Esta solución se transfirió a 9 mL de solución salina 0.85% (p/v) filtrada (0.22 µm) y estéril, se agitó en vortex y se filtró empleando un filtro de policarbonato negro de 0.22 μm y 25 mm de diámetro (GTBP02500; Millipore) con ayuda de una bomba de vacío (25 psi) (ROA-P164-

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AA:GAST). El filtro se dejó secar por 20 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se agregaron 100 μL de DAPI (5 μg/mL) (D9542; Sigma) (Anexo A) y se dejó reaccionar por 30 min. Luego se lavó el filtro con agua Milli-Q por 1 min, seguido de etanol (Merck) al 70% (v/v) por 2 seg y se dejó secar en oscuridad a temperatura ambiente por 1 h. Este procedimiento se realizó por duplicado para cada muestra.

El filtro seco se colocó en una lámina porta objetos, se agregó una gota de aceite Citifluor AF1 (No.17970-25; Electron Microscopy Science) y se colocó una laminilla evitando la formación de burbujas. Para realizar la lectura de cada filtro en el microscopio de eplifluorescencia (Eclipse 5.0i; Nikon) se empleó un aceite de inmersión de baja luminiscencia (50 tipo NF, Nikon), se enfocó con el objetivo 100x y se realizaron las lecturas en el filtro 1 y/o 4. Se consideró como células los óvalos, puntos y círculos con bordes definidos con coloración azul fluorescente.

Si se observaba un número de células por campo de lectura menor a 30, se leían 50 campos aleatorios por filtro; en caso contrario, se leían 20 campos aleatorios por filtro (Anexo B y C) (Figura 3).

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5.4.2.2. Conteo de microorganismos heterótrofos

Se sembró en superficie 0.1 mL de las tres últimas diluciones realizadas a cada una de las muestras sobre agar R2A (Oxoid) (Anexo D) por duplicado y se dejaron incubando a 21±2ºC por 5 d. Posterior a este tiempo se contaron las cajas que presentaron entre 30 a 300 UFC (Figura 4).

Figura 4. UFC de heterótrofos en agar R2A de una muestra de suelo

Latorre (2007) evaluó diferentes medios de cultivo con alto y bajo concentración de nutrientes para la recuperación de microorganismos heterótrofos en suelos de la misma zona de muestreo y determinó que con el agar R2A, un medio con baja concentración de nutrientes, se obtuvieron los mayores conteos, por esta razón en el presente estudio se empleó este medio de cultivo.

5.4.3. Controles utilizados durante el procesamiento de las muestras

Para llevar a cabo el control en el procedimiento del conteo de microorganismos totales durante los eventos de muestreo se realizó una suspensión de E. coli tomando una asada de un cultivo puro de 24 h en 4.5 mL de solución salina 0.85% (p/v) filtrada (0.22 µm) y estéril, la cual se homogenizó en vortex durante 1 min. Posteriormente se realizaron diluciones seriadas con base 10 y se llevo a cabo el

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procedimiento para el conteo directo con DAPI y recuenteo en placa sobre agar nutritivo, el cual se llevó a incubación durante 24 h a 37°C. Finalmente, los datos obtenidos se colocaron en la curva UFC/mL vs. células/mL obtenida anteriormente, para determinar si los controles que se realizaron se encontraban dentro del intervalo de confianza del 95%.

Con el fin de confirmar la esterilidad de los materiales y reactivos empleados se realizaron controles a los rastrillos, a las puntas para micropipeta, a la solución salina 0.85% (p/v) filtrada (0.22 µm) y estéril y al agar R2A. La esterilidad de los rastrillos se realizó haciendo un frotis directamente sobre el medio de cultivo. Para el análisis de las puntas se realizó un enjuague con solución salina 0.85% (p/v) filtrada (0.22 µm) y estéril y se inoculó con la misma punta un volumen de esta solución sobre el agar. El control de esterilidad de la solución salina 0.85% (p/v) filtrada (0.22 µm) y estéril se llevó a cabo inoculando un volumen de ésta sobre el medio. Finalmente una caja de petri con medio de cultivo R2A fue incubada sin haber sido inoculada con el fin de corroborar su esterilidad. Estos controles se realizaron diariamente durante los días de procesamiento.

El medio de cultivo empleado para realizar todas las pruebas de esterilidad fue el agar R2A, el cual se incubó a las mismas condiciones que las muestras.