ANÁLISIS DE PIGMENTOS

9.1. Extracción de carotenoides desde cultivos bacterianos

Las colonias aisladas de las diferentes cepas de E. coli productoras de carotenoides fueron sembradas en triple estría en medio LB-agar suplementado con 1 mM IPTG, ampicilina (50 μg/mL) y cloranfenicol (34 μg/mL) y se incubó a 28 ºC en oscuridad durante 48 h.

Dos colonias aisladas de cada siembra fueron inoculadas en 5 mL de LB suplementado con 1 mM IPTG, ampicilina (50 μg/mL) y cloranfenicol (34 μg/mL) y se incubó durante 12 h a 37 ºC con agitación (200 rpm). Diez μL de este precultivo se utilizó para inocular 20 mL de LB suplementado con 1 mM IPTG, ampicilina (50 μg/mL) y cloranfenicol (34 μg/mL). Este cultivo se incubó a 28 ºC en oscuridad y con agitación (200 rpm) durante 48 h.

Una alícuota de 10 mL de este cultivo se centrifugó 5 min a 4000 g y el sedimento bacteriano se lavó dos veces con agua destilada. A continuación, el sedimento se resuspendió en 3 mL de acetona (Sigma) y se homogenizó con el vortex (10 min a 4 ºC), luego se centrifugó a 13000 g durante 2 min a 4 ºC. El sobrenadante se recuperó en un tubo falcon de 15 mL limpio, se secó en corriente de N2 y el extracto se almacenó a -80 ºC hasta día de su análisis por HPLC. Para la extracción de carotenoides desde la cepa BL-EBILWZ el sedimento bacteriano se resuspendió en 3 mL de acetona (Sigma-Aldrich) y se homogenizó con el vortex (10 min a 4 ºC) y luego el extracto en solución se combinó con 5 mL de hexano y 1 mL de fosfato potásico 0.1 mM. Esta mezcla se agitó con vortex para homogenizar y se centrifugó a 4500 rpm por 10 min para separar las fases. Se transfirió la fase superior que contenía los carotenoides a un nuevo tubo. Esta extracción se repitió hasta que el residuo celular quedó incoloro.

El extracto final en solución, se evaporó bajo corriente de N2 y se conservó a -80 ºC hasta su análisis por HPLC. Todas las manipulaciones fueron realizadas en frío y con luz baja, para prevenir la fotodegradación, isomerización u otros cambios estructurales en los carotenoides.

9.2. Extracción de carotenoides desde cepas transformantes de Pichia pastoris

Con el fin de maximizar la recuperación de carotenoides desde las cepas recombinants de P. pastoris, se compararon varios métodos de ruptura celular:

83 - Tratamiento 1; Perlas de vidrio y agitación en vortex: A un tubo Falcon que contenía 50 mg de biomasa celular liofilizada se le agregó 0.2 g de perlas de vidrio (0.45 mm de diámetro) y 10 mL de acetona y se agitó en vortex por 10 min.

- Tratamiento 2; Ultrasonido: 50 mg de celulas liofilizadas disueltas en 10 mL de acetona fueron puestas en un baño con ultrasonido (Ultrasons 250, Selecta S.A.). Se realizó cuatro ciclos de sonicación de 40 W RMS, 20 kHz, 10 min, (Medeiros et al., 2008).

- Tratamiento 3; Dimetil sulfoxido (DMSO): 50 mg de celulas liofilizadas fueron incubadas en 3 mL de DMSO (pre calentado a 55 ºC) por 30 min, luego se agitó intensamente en vortex por 1 min y se dejó en reposo por 30 min. (Dos Santos da Fonseca et al., 2011).

- Tratamiento 4; Mixto: 50 mg de celulas liofilizadas fueron incubadas en 3 mL de DMSO (pre calentado a 55 ºC) por 30 min, luego se agitó con perlas de vidrio de 0.45 mm en un homogenizador Braun (MSK) en 6 ciclos de 30 s cada uno, se enfrió con CO2 durante 1 min entre ciclos. Luego se dejó en reposo por 30 min y se sónico en un baño con hielo por 10 min. Para todos los tratamientos de ruptura, la extracción de carotenos se realizó según lo descrito por (Bhataya et al., 2009), con algunas modificaciones. A la suspensión celular de cada tratamiento se le añadió 10 mL de acetona y se sometió a vortex intenso por 5 min a 4 ºC. Los extractos fueron luego combinados y particionados agregando un volumen de 10 % dietil éter, en éter de petróleo para facilitar la separación y remover la acetona disuelta, además se agregó a la mezcla, 1 mL de agua destilada y se agitó con vortex por 30 s seguido de centrifugación a 3000 g por 10 min. Se transfirió la fase superior que contenía los carotenoides a un nuevo tubo. Esta extracción se repitió hasta que el residuo celular quedó incoloro.

El extracto final en solución, se evaporó bajo corriente de N2 y se conservó a -80 ºC hasta su análisis por HPLC.

Para la extracción de xantofilas se utilizó un procedimiento mixto que incluyó la incubación con DMSO (previamente calentado a 55 ºC) por 30 min y luego una fuerte agitación en presencia de perlas de vidrio de 0.45 mm, se empleó un homogenizador Braun (MSK), por 6 ciclos de 30 s cada uno, se enfrió con CO2 durante 1 min entre ciclos. Posteriormente se mantuvo en reposo por 30 min. A esta suspensión celular se le agregaron 10 mL de acetona y se agitó con vortex por 5 min a 4 ºC. Los extractos fueron entonces combinados con 5 mL de hexano y 1 mL de fosfato potásico 0.1 mM. Esta mezcla se agitó con vortex para homogenizar y se centrifugó a 4500 rpm por 10 min para separar las fases. Se transfirió la fase

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superior que contenía los carotenoides a un nuevo tubo. Esta extracción se repitió hasta que el residuo celular quedó incoloro. El extracto final en solución, se evaporó bajo corriente de N2 y se conservó a -80 ºC hasta su análisis por HPLC. Todos los tratamientos y manipulaciones anteriores, fueron realizados en frío y en condiciones de baja luz para prevenir la fotodegradación, isomerización y cambios estructurales de los carotenoides.

9.3. Identificación y cuantificación de carotenoides mediante HPLC

Para el análisis por HPLC, se resuspendió las muestras secas en 2 mL de cloroformo:metanol:acetona (3:2:1, v/v) (pureza HPLC, Carlo Erba) y se filtró a través de filtros de policarbonato de 0.22 μm. La identificación y cuantificación de los carotenoides individuales se realizó por cromatografía líquida de alta resolución acoplada a detector de fotodiodos (HPLC-PDA). La cromatografía se llevó a cabo en un sistema de cromatografía líquida Waters, se utilizó una columna C30 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) (YMC Europa GMBH). Los datos se adquirieron y procesaron con el paquete informático Empower2 (Waters). El volumen de muestra inyectada fue de 20 μL, el flujo de inyección en la columna se mantuvo a 1 mL/min y la temperatura de la columna se fijó a 25 ºC.

Para la separación de los carotenoides se utilizó el gradiente terniario de elución de metanol (MeOH), agua (H2O) y metil tert-butil eter (MTBE) que se detalla en la tabla 7.

Tabla 7. Gradiente de elución utilizado para la separación de carotenoides mediante HPLC. Los cambios de gradiente se realizaron de forma lineal.

El detector de fotodiodos se programó para registrar las absorbancias cada 1 nm desde 250 nm hasta 600 nm a lo largo de toda la elución. Para cada muestra se obtuvo un cromatograma MaxPlot, en el que se presentó el tiempo frente a la absorbancia máxima en el rango de longitudes de onda registradas.

Tiempo (min) 0 12 20 30 50 70 75

MTBE (Metil tert-butil éter) 5 5 14 25 50 75 5

H2O (Agua) 5 0 0 0 0 0 5

85 Los carotenoides fueron identificados por comparación del espectro y del tiempo de retención con los estándares disponibles o con los datos de espectros y tiempos de retención obtenidos en condiciones cromatográficas similares disponibles en la literatura (Rouseff et al., 1996; Meléndez Martínez et al., 2003; Rodrigo et al., 2003; Rodrigo et al., 2004) y para el caso de ζ-caroteno y neurosporeno, se utilizó los pigmentos extraídos desde las cepas recombinantes control (BL-EBP y BL-EBR), respectivamente.

En los cromatogramas MaxPlot los picos cromatográficos correspondientes a cada carotenoide fueron integrados en su λ máxima y su contenido se calculó utilizando una curva de calibrado comparada con las áreas de cada pico obtenidas en los cromatogramas. Se realizó una curva de calibrado o recta patrón para el β-caroteno (Sigma-Aldrich).

10. ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE ACRILAMIDA (SDS-