TÉCNICAS DE TRANSFORMACIÓN

7.1. Transformación de Escherichia coli

7.1.1. Células quimiocompetentes de Escherichia coli, método de Cl2Rb

Para la preparación de células quimiocompetentes de E. coli (cepas comerciales), se utilizó el método de Cl2Rb. Se inoculó un matraz de LB con E. coli y se cultivó toda la noche a 37 ºC hasta que alcanzó la fase estacionaria. Al día siguiente, se transfirió 2 mL de este cultivo a un matraz con 100 mL de LB. Se cultivó durante 2-3 h a 37 ºC y 200 rpm hasta que la D.O. a 550 nm alcanzó un valor de 0.3 - 0.4. El cultivo se enfrió 5 min en hielo. Se centrifugó a 8000 rpm a 4 ºC. El sedimento se resuspendió en 30 mL de TfbI estéril frío. Se centrifugó a 8000 rpm a 4 ºC durante 10 min. El concentrado celular se resuspendió en 4 mL de TfbII estéril. Finalmente, se repartió la suspensión en viales estériles con alícuotas de 100 L cada uno. Cada tubo se congeló inmediatamente con N2 líquido y fueron conservados a - 80 ºC. Para la preparación de células quimiocompetentes de las cepas de E. coli BL-EBP, BL-EBR, BL-EBI y BL-EBIL se realizó siguiendo el mismo procedimiento descrito.

A continuación se describen las soluciones empleadas:

TfbI 1.47 g de CH3COOK 4.95 g de MnCl2 6.05 g de Cl2Rb 0.74 g de CaCl2.6.H2O 75 mL de glicerol

Se ajustó el pH a 5.8 con ácido acético glacial 0.2 M, se filtró a través de membranas de 0.22 m y se guardó a 4 ºC.

77 TfbII 10 mL de MOPS 100 mM, pH 7 1.6 g de CaCl2.6.H2O 0.12 g de Cl2Rb 18 mL de glicerol

Se filtró a través de membranas de 0.22 m y se guardó a 4 ºC en oscuridad.

MOPS (100 mM, pH 7)

2.09 g de MOPS 0.34 g de CH3COONa 0.18 g de EDTA

Se ajustó el pH a 7, se enrasó hasta 100 mL con agua destilada y se filtró a través de membranas de 0.22 m.

7.1.2. Células electrocompetentes de Escherichia coli

A partir de un cultivo de E.coli (cepa comercial) se sembró mediante triple estría una placa con medio LB-agar y se incubó a 37 ºC durante la noche. Una colonia aislada procedente de la placa se inoculó en 20 mL de medio LB y se cultivó durante la noche a 37 ºC con agitación 180 rpm. Al día siguiente 5 mL del pre-inóculo se añadió a un matraz de 1 L que contenía 500 mL de medio LB y se incubó a 37 ºC en agitación hasta que alcanzó la fase exponencial. A partir de este punto todas las manipulaciones fueron realizadas en frío. Las células fueron centrifugadas 10 min a 1500 g, se descartó el sobrenadante y se lavó las células 2 veces con 400 mL de agua destilada enfriada a 4 ºC, se centrifugó cada vez 10 min a 1500 g. A continuación se resuspendió en 10 mL de glicerol 10 % (4 ºC) y se centrifugó 10 min a 1500 g. Finalmente, se resuspendió las células en 1 mL de glicerol 10 % (4 ºC) y se distribuyó en alícuotas de 40 μL en tubos Eppendorf estériles. Los tubos se congelaron inmediatamente en N2 líquido y se almacenaron a -80 ºC hasta el momento de su transformación.

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7.1.3. Transformación de Escherichia coli por shok térmico

La transformación se llevó a cabo añadiendo la mezcla de la ligación (10 μL) o el plásmido recombinante (100 ng en un volumen máximo de 10 μL) a 100 μL de las células quimiocompetentes e incubando la mezcla durante 30 min en hielo. Después se dió un choque de calor a 42 ºC durante 45 s y se dejó enfriar en hielo por 2 min, luego se añadió 250 μL de medio LB o SOC y se incubó durante 1 h a 37 ºC con agitación (180 rpm). Finalmente las células se sembraron en placas Petri con medio LB-agar.

En los casos en que el plásmido utilizado contenía el gen lacZ para la α complementación, se añadió a las placas X-Gal (1 μL/mL de una solución de 20 mg/mL en formamida) y el inductor IPTG, además del antibiótico adecuado. Para las transformaciones con el vector pET21a, no se agregó X-Gal y para las co-tranformaciones con dos plásmidos o tres, las placas se suplementaron con ampicilina (50 µg/mL) y cloranfenicol (34 µg/mL). Para la expresión de carotenoides en E coli recombinantes los cultivos se incubaron por 48 h a 28 ºC y en oscuridad.

7.1.4. Transformación de Escherichia coli por electroporación

A una alícuota de 40 μL de células electrocompetentes descongelada en hielo se añadió el vector transformante (2 μL de la ligación ó entre 50 y 100 ng de DNA plasmídico purificado, en un volumen máximo de 10 μL). Esta mezcla se introdújo en una cubeta de 2 mm de separación de electrodos (BioRad) pre enfriada en hielo y se incubó 5 min. Posteriormente la cubeta se insertó en un aparato Bio-Rad Micropulser (BioRad) y fue sometida a un pulso eléctrico.

Las condiciones de electroporación utilizadas fueron: 125 μF de conductancia, 200 Ω de resistencia y un voltaje de 2500 V. Tras el púlso eléctrico se añadió inmediatamente a la cubeta 1 mL de medio SOC a temperatura ambiente, se resuspendió las células transformadas y se transfirió a un tubo Eppendorf estéril, donde se incubó a 37 ºC con agitación durante 1 h. Finalmente, las células fueron sembradas en placas Petri con medio LB-agar que contenía X- Gal (1 μL/mL de una solución de 20 mg/mL en formamida) y suplementado con ampicilina (50 µg/mL).

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7.2. Transformación de Pichia pastoris

Las células de P. pastoris X33 fueron crecidas en 5 mL de medio YPD a 30ºC, con agitación rotatoria a 200 rpm toda la noche. Este cultivo se utilizó para inocular 500 mL de medio YPD que se incubó en las mismas condiciones hasta alcanzar la fase exponencial de crecimiento. El cultivo se centrifugó a 1500 g por 5 min a 4 ºC se descartó el sobrenadante y se resuspendió en 500 mL de agua esteril a 4 ºC. Después se centrifugó por segunda vez y se resuspendió en 20 mL de sorbitol 1M frío (4 ºC), se centrifugó por tercera vez y finalmente se resuspendió en 1 mL de sorbitol 1 M frío. Se conservó las células en hielo hasta su transformación.

Por otro lado, el plásmido recombinante pGAPZA-EBI* se linealizó con la enzima de restricción AvrII (New England BioLabs) y posteriormente se purificó y resuspendió en un volumen de 10 µL de agua MilliQ a una concentración final de 1000 ng/µL.

P. pastoris X33 se transformó con éste vector de expresión mediante electroporación. Se utilizó el electroporador Bio-Rad Micropulser (BioRad). Para esto, se mezcló 80 µL de células electrocompetentes con los 10 µL del vector lineal en una cubeta de electroporación de 0.2 cm (BioRad), se incubó en hielo 5 min y luego se aplicó un pulso de 1500 V, 200 Ω y 25 µF. Tras el cual se agregó inmediatamente 1 mL de sorbitol 1 M frío. El contenido de la cubeta se traspasó a un tubo falcon de 15 mL estéril y se incubó por 2 h a 30 ºC sin agitación. Las colonias transformantes, nombradas como Pp-EBI, fueron seleccionadas en placas con medio YPDS suplementado con Zeocina (100 µg/mL), (Invitrogen). Se incubó las placas a 30 ºC hasta que las colonias fueron visibles (48–72 h), luego se incubó por 48-72 h a temperatura ambiente hasta que su coloración fue evidente.

Por su parte, el plásmido pGAPZA-EBI*L* se linealizó con la enzima AvrII y se integró en el DNA genómico de P. pastoris X-33 siguiendo el mismo procedimiento anterior. Las levaduras transformantes obtenidas fueron nombradas como Pp-EBIL.

Finalmente, el plásmido pGAPZA-WZ se linealizó con la enzima AvrII, pero se integró en el DNA genómico de la cepa recombinante de P. pastoris productora de β-caroteno (Pp-EBIL), siguiendo el mismo procedimiento anterior. La cepa recombinante obtenida de esta nueva integración se nombró como Pp-EBILWZ.

La integración de todos los genes heterólogos en el DNA genómico de las diferentes cepas de P. pastoris se comprobó por PCR, utilizando los cebadores específicos de cada gen y como molde el DNA genómico de cada clon seleccionado.

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