ANÁLISIS IN SILICO DE LOS GENES TOP

La subfamilia TOP está formada por cuatro miembros: TOP1(At1g01030),

TOP2 (At4g01500), TOP3 (At3g61970), y TOP4 (At2g46870), localizados en cuatro de

los cinco cromosomas de Arabidopsis. En la figura IV-1 se muestra un esquema de la localización de los distintos genes TOP en los cromosomas de Arabidopsis, a partir de lo publicado en el TAIR. En esta figura se puede observar que los cuatro genes se localizan en regiones cercanas al telómero.

Como ya se ha explicado, los genes TOP forman una pequeña subfamilia de factores de transcripción perteneciente a la gran familia de factores de transcripción con dominio B3. Los cuatro miembros codifican proteínas relativamente pequeñas (Fig. IV- 2), en las que no se puede identificar ningún motivo ya descrito mas que el motivo B3 que es un dominio de unión a DNA exclusivo de plantas (Bateman et al., 2004). La subfamilia TOP también ha sido denominada NGATHA (Alvarez et al., 2006).

Los genes TOP evolucionaron de forma que dentro de la familia TOP se pueden encontrar dos subgrupos. Según la homología en la secuencia de núcleotidos y de aminoácidos, TOP1 y TOP2 formarían uno de los subgrupos y TOP3 y TOP4 otro.

Fig. IV-1: Localización de los genes TOP en los cromosomas de Arabidopsis. TOP1 en el cromosoma 1, TOP2 en el cromosoma 4, TOP3 en el cromosoma 3 y TOP4 en el cromosoma 2.

Modificado a partir de los publicado en el TAIR.

Fig. IV-2: Esquema de los dominios encontrados en las proteínas TOP, a partir de lo publicado en el Pfam. TOP1 (358 residuos aminoacídicos). TOP2 (328 residuos aminoacídicos). TOP3 (299 residuos aminoacídicos). TOP4 (310 residuos aminoacídicos).

Dentro de la familia TOP el miembro que podría considerarse más ancestral sería

TOP1. Además, es el único que posee dos exones y un intrón (Fig. IV-6).

La homología de secuencia entre los genes TOP se extiende a las regiones reguladoras. De nuevo, las regiones promotoras de TOP1 y TOP2 son más parecidas entre sí, y las de TOP3 y TOP4 entre sí. En la figura IV-3B se muestra la comparación de las secuencias genómicas de TOP1 frente a TOP2 y de TOP3 frente a TOP4. En la figura IV-3A se incluyen los genes adyacentes a TOP1 y TOP2. Mientras que At1g01040 y At4g01490 no están relacionados, At1g01020 y At4g01510 codifican proteínas homólogas ARE2 REQUIERED FOR VIABILITY1 (ARV1) y ARV2, similares a Arvp1 implicada en la regulación de la homeostasis celular de los lípidos en

Saccharomyces cerevisiae (Fores et al., 2006) (Tinkelenberg et al., 2000).

En el trabajo de Thomas Jack (ver introducción) se ha colocado a la subfamilia

TOP dentro de la familia RAV por la similitud de los dominios B3 (Fig IV-4). Sin

embargo, los miembros de la familia TOP formarían un subgrupo dentro de la familia

RAV ya que, a diferencia del resto de miembros que poseen dominios AP2, los TOP no

poseen otros dominios de unión a DNA mas que el B3.

Fig. IV-3: (A) esquema representativo de las regiones genómicas de TOP1 y TOP2. Las regiones en azul oscuro representan regiones codificantes de elevada similitud entre TOP1 y TOP2. Las regiones en azul claro representan regiones codificantes de menor similitud entre TOP1 y TOP2. Las regiones en gris representan regiones no codificantes de elevada similitud entre TOP1 y TOP2. Las regiones en rosa representan regiones codificantes no similares. Se detallan los genes adyacentes a TOP1 y TOP2. (B) Comparación de las secuencias genómicas de TOP1, TOP2, TOP3 y TOP4. Se compara TOP1 con TOP2 y TOP3 con TOP4. Las secuencias genómicas incluyen las regiones 5´y 3´, se ha destacado en amarillo la ORF.

En la figura IV-5 se muestra un alineamiento realizado con las secuencias de las distintas proteínas TOP. En este esquema se han destacado en distintos colores los distintos motivos que se encuentran en las proteínas TOP, además del motivo B3 (destacado en azul). Se pueden encontrar 4 motivos más, coloreados en; añil (motivo 1), morado (motivo 2), verde (motivo 3) y amarillo (motivo 4). Cabe destacar que el motivo 4 tiene una secuencia similar a los motivos tipo EAR (Ohta et al., 2001) (Tsukagoshi et al., 2005) (Kieffer et al., 2006).

Fig. IV-4 : Árbol filogenético de la familia RAV. Modificado a partir de lo descrito por Thomas Jack. Los cuadros rosas indican los niveles de expresión en diferentes tejidos; R: raíz, L: hoja, M: meristemo del tallo, F: flor, S: semilla. A la derecha se encuentran esquemas de las proteínas indicando los dominios B3 y los dominios AP2. Se han destacado los genes TOP en rojo y sus homólogos de arroz en azul y de Marchantia polymorpha en verde.

En el genoma del arroz se encuentran 6 genes muy similares a los genes TOP de

Arabidopsis y que como éstos, no poseen dominios AP2 (Fig. IV-4). Estos genes son:

Os02g45850, Os03g02900, Os06g01860, Os04g49230, Os10g39190, Os08g06120. De las 6 proteínas de arroz, 2 de ellas comparten el motivo 1 (Os10g39190 P y Os03g02900 P) , 4 de ellas el motivo 2 (Os10g39190 P, Os08g06120 P, Os02g45850 P y Os03g02900 P) y 3 de ellas el motivo 4 que es parecido al motivo EAR (Os10g39190 P, Os02g45850 P y Os03g02900 P) (Fig. IV-5 B). La proteína Os06g01860 P es muy pequeña (143 aa) y no se ha utilizado en este alineamiento.

Fig. IV-5: Alineamientos de secuencias proteicas. (A) Alineamiento de las secuencias de las proteínas TOP de Arabidopsis. Se ha destacado el dominio B3 y los distintos motivos característicos de las proteínas TOP. (B) Alineamiento de las regiones C-terminales de las proteínas TOP en

Por otra parte, cabe destacar que los dominios B3 de los TOP son muy similares al dominio B3 de la proteína Q8H6E4 de la planta dioica Marchantia polymorpha, aunque en este caso, la proteína tiene dos dominios B3 (Ishizaki et al., 2002; Okada et

al., 2001) (Fig. IV-4).

2. CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LOS GENES TOP.