I. INTRODUCCIÓN
5. Arabidopsis thaliana COMO ORGANISMO MODELO PARA EL
5-1. Aspectos generales.
Hasta bien entrado el siglo XX, la mayoría de los estudios en plantas se realizaron utilizando especies de interés económico como el maíz, el tomate y el guisante, con el fin de mejorar sus cultivos. Sin embargo, estas plantas presentan muchos inconvenientes que dificultan su análisis y su manipulación en el laboratorio. Por este motivo, desde mediados de los años 80 se ha generalizado la utilización de Arabidopsis thaliana para la investigación del desarrollo vegetal (Somerville y Koornneef, 2002). Arabidopsis es una angiosperma dicotiledónea perteneciente a la familia de las crucíferas o brasicáceas, a la que también pertenecen especies como la col (Brassica oleracea), el rábano (Raphanus sativus) y las mostazas (Sinapis sp.; (Strasburger, 1994) ). Aunque no tiene valor económico, sus características la convierten en un organismo modelo muy apropiado para su estudio en el laboratorio. Presenta un tamaño pequeño, con alrededor de treinta centímetros de altura máxima, lo que permite siembras de alta densidad; su arquitectura es relativamente simple, y su ciclo vital, de unos dos meses, resulta corto para una planta con flores. Además es autógama, es decir, se autopoliniza sin intervención externa, y produce un gran número de semillas, lo que facilita la propagación de las diversas líneas. También resulta relativamente fácil realizar cruzamientos entre distintas plantas (Somerville y Koornneef, 2002).
Arabidopsis es una planta diploide cuyo genoma, que ha sido totalmente secuenciado (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000), se organiza en cinco cromosomas y es muy apropiado para los estudios moleculares por su pequeño tamaño (125 Mb) y su escaso contenido en DNA repetitivo. Su uso intensivo en investigación ha propiciado la creación de bases de datos de dominio público en las que se ofrecen gran cantidad de herramientas informáticas, así como información acerca de mutantes, polimorfismos de DNA, protocolos de laboratorio, etc. Una de las más importantes es el TAIR (The Arabidopsis Information Resource, http://www.arabidopsis.org).
Existen numerosas estirpes de Arabidopsis aisladas en localizaciones concretas y que presentan algunas diferencias morfológicas entre sí, que reciben el nombre de ecotipos o accesos y son tomados como referencia para definir la morfología normal (silvestre o wild type) de las plantas (Alonso-Blanco, 2000). Los más utilizados son Columbia-0 (Col-0) y Landsberg erecta (Ler), pese a que este último es homocigótico para la mutación erecta, que afecta de forma notable a la arquitectura general de la planta (Tsukaya et al., 1995; Tsukaya et al., 1993).
5-2. Morfología y ciclo vital.
La embriogénesis establece finalmente un esbozo de la estructura corporal de la planta, con los dos meristemos principales establecidos, una radícula y dos cotiledones u hojas embrionarias cuya función principal es servir de órganos de reserva durante las primeras etapas tras la germinación (Figs. I-2A y I-3; (Bowman, 1994; Wolpert, 2002)).
Durante toda la fase vegetativa, el SAM produce hojas separadas por entrenudos muy cortos, lo que da como resultado una roseta compacta (Figs. I-2B y I-3). La duración de esta etapa es, en general, proporcional al número final de hojas de la roseta y depende de las condiciones de cultivo y del ecotipo (Bowman, 1994).
Durante la fase reproductiva, a partir del meristemo de la inflorescencia se forma el tallo principal debido a un incremento de la longitud de los entrenudos (Figs. I-2C y I-3). Los meristemos laterales, asociados a las axilas de las hojas caulinares, generan ramificaciones del tallo. En los extremos del tallo principal se forman las inflorescencias, con las flores dispuestas en racimo (Figs. I-2D y I-3). La flor alcanza la madurez en el denominado estadio de antesis (Tabla I-1), en el que tiene lugar la autopolinización y la fertilización de los óvulos, que desencadenan el desarrollo de las semillas y la fructificación. Al final de la fase reproductiva, la planta se seca permitiendo la liberación de las semillas contenidas en sus frutos (Bowman, 1994; Wolpert, 2002).
El fruto seco y dehiscente de Arabidopsis thaliana, denominado silicua es el típico fruto de más de 3000 especies de la familia Brassicaceae (Rollins, 1993) por lo que mucho del conocimiento sobre Arabidopsis podría extrapolarse a otras especies dentro de esta familia u otras ya que, como se ha mencionado, el fruto de Arabidopsis recuerda al fruto ancestral.
Fig. I-2. Diferentes estadios del desarrollo de Arabidopsis. Embrión maduro (A), roseta vegetativa (B), planta adulta (C), detalle de la inflorescencia (D).
6. Arabidopsis thaliana COMO ORGANISMO MODELO PARA EL ESTUDIO DEL DESARROLLO DEL GINECEO.
6-1.El gineceo de Arabidopsis.
La flor de Arabidopsis mide unos 2 mm. y consta de cuatro verticilos concéntricos de órganos que presentan la organización típica de las crucíferas (Fig. I-4; Bowman, 1994). Los dos primeros verticilos están compuestos por cuatro sépalos y cuatro pétalos respectivamente. El tercero está formado por seis estambres, cada uno de los cuáles comprende un filamento y la antera, en la que se forma y madura el polen. Por último, en el cuarto verticilo dos carpelos fusionados dan lugar al gineceo, el órgano reproductor femenino.
El gineceo alcanza la madurez en el estadio de antesis, cuando ocurre la dehiscencia de las anteras y la flor está completamente abierta. En este estadio, todos los tejidos necesarios para la fertilización están desarrollados y los tejidos necesarios para la maduración y la posterior dehiscencia están presentes, aunque se desarrollarán completamente tras la formación del fruto.
Fig. I-3. Ciclo vital de Arabidopsis. Se indican los principales eventos y las estructuras más relevantes de cada estadio. Modificado a partir de Wolpert et al. (2002).
En el gineceo en antesis, se pueden distinguir en un eje apical-basal, de arriba hacia abajo, el estigma, el estilo, el ovario y el ginóforo basal que une el ovario a la base de la flor (Fig. I-5 izquierda).
El estigma está compuesto de numerosas células epidérmicas alargadas que se denominan papilas estigmáticas (Sessions y Zambryski, 1995). Estas células están especializadas en la adherencia de los granos de polen y sólo pueden inducir la germinación del mismo en la fase de antesis (Nasrallah et al., 1994). El estigma también representa el comienzo del tracto de transmisión, un tejido rico en polisacáridos especializado en dirigir el crecimiento del tubo polínico hacia los óvulos.
El tracto de transmisión está organizado en filas verticales de células conectadas por los extremos a través de plasmodesmos y secreta una matriz extracelular mucilaginosa. El tracto de transmisión continúa a lo largo del estilo y del septum del ovario para facilitar la fertilización de los óvulos (Sessions y Zambryski, 1995).
El estilo aparece como un cilindro corto y sólido con una morfología epidérmica distintiva (Bowman, 1994). Las células epidérmicas se disponen en filas cortas y tienen
Fig. I-5. Micrografía electrónica de barrido coloreada de una flor de Arabidopsis. Se señalan los 4 tipos de órganos principales. Tomado de S cience Photo
Library (www.sciencephoto.com) con modificaciones.
Fig.I-5: Micrografía electrónica de barrido del gineceo de Arabidopsis en antesis (izquierda) y sección transversal del ovario (derecha). Se indican los ejes de polaridad y los distintos tejidos. Modificado a partir de Balanzá et al (2006)
Fig. I-4. Micrografía electrónica de barrido coloreada de una flor de Arabidopsis. Se
señalan los 4 tipos de órganos principales. Tomado de Science Phote Library
depósitos estriados de ceras. El centro del estilo está formado por células elongadas axialmente de tejido del tracto de transmisión rodeadas por un anillo de tejido vascular. Entre el centro y la capa única de epidermis se encuentran tres capas de tejido clorenquimático (Sessions y Zambryski, 1995). En antesis existen estomas funcionales en el estilo (Sessions y Zambryski, 1995).
El ovario está compuesto por dos valvas conectadas externamente por los repla. Internamente está dividido en el plano medio por el septum, formando una cámara bilocular dentro de la cual se posicionan los óvulos. La pared externa de la valva muestra una clara diferencia entre las dos valvas y el replum (Bowman, 1994).
En una sección transversal del ovario se puede observar la distribución en el eje medio-lateral (Fig. I-5 derecha). Las valvas corresponden a las dos paredes del carpelo y se encuentran en las posiciones laterales. Dentro de la valva se pueden distinguir varias capas de células: el exocarpo o epidermis externa, que comprende una línea única de células intercalada con estomas inmaduros y sin abrir; tres capas de células del clorénquima que forman el mesocarpo; y por último el endocarpo, que consiste en dos capas de células diferenciadas: una capa de epidermis interna formada por células isodiamétricas con pared celular fina (ena) y una capa de pequeñas células subepidérmicas estrechamente alineadas que se elongan longitudinalmente (enb) (Sessions y Zambryski, 1995) (Spence et al., 1996). Las valvas acaban en una columna de células pequeñas, que forman una depresión longitudinal, denominada margen de valva.
En las posiciones mediales del ovario se encuentran el replum (lado abaxial del septum), el septum, la placenta y los óvulos que de ella derivan. Todos estos tejidos mediales, junto con el estilo y estigma apicales se denominan en conjunto tejidos marginales ya que derivan de los márgenes del carpelo fusionado. Los tejidos marginales muestran polaridad abaxial/adaxial. Las posiciones abaxiales están ocupadas por el replum, y las adaxiales por el septum, el tracto de transmisión, la placenta y los óvulos (Balanzá et al., 2006) (Fig. I-6).
Fig. I-6: Micrografía electrónica de barrido del gineceo de Arabidopsis en estadio 7 (A). Los dominios mediales se ha coloreado en amarillo y los dominios laterales en verde. Sección transversal del ovario de Arabidopsis en antesis (B). Los diferentes tejidos se han coloreado para distinguir el tejido medial (o marginal) en amarillo/naranja y los tejidos laterales en verde/azul. Modificado a partir de Balanzá et al (2006).
Los óvulos son estructuras complejas que consisten en un nucelo central que contiene el saco embrionario, dos integumentos que engloban al nucelo, y un funículo que los conecta al tejido de la placenta (Bowman, 1994; Robinson-Beers et al., 1992).
En los frutos maduros los diferentes tejidos se desarrollan para asegurar la dehiscencia, es decir, el proceso mediante el cual el fruto se abrirá para dispersar las semillas (Fig. I-7). Durante la maduración del fruto, en las valvas, las células del endocarpob (enb) forman depósitos de lignina, un polímero fenólico que proporciona rigidez a la pared celular. En los márgenes de la valva se diferencia la zona de dehiscencia. En ésta se distinguen dos capas de tejido. La zona lignificada (LL, Lignified Layer) se encuentra dentro del margen de valva, en la zona más cercana a la valva y está formada por una o dos capas de células estrechas que se lignifican. Esta zona se continúa con la capa enb, y junto a ésta provocará los mecanismos de tensión que separarán el replum de la valva en la dehiscencia del fruto (Spence et al., 1996). En la zona del margen de valva cercana al replum se localiza la zona de separación (SL, Separation Layer), formada por células isodiamétricas. Las células de esta zona, durante la dehiscencia degeneran la lamela existente entre las paredes celulares y se separan unas de otras (Dinneny y Yanofsky, 2005) (Jenkins et al., 1999) (Petersen et al., 1996).
El gineceo está recorrido longitudinalmente por cuatro haces vasculares principales, dos mediales y dos laterales. Los haces vasculares mediales corren longitudinalmente a lo largo de los repla suministrando nutrientes al tejido placentario y ramificándose hacia los óvulos. Estos haces vasculares se bifurcan al final del ovario para formar los vasos de xilema que se encuentran en el estilo. Las venas mediales se encuentran altamente lignificadas y puede que contribuyan también al proceso de dehiscencia (Balanzá et al., 2006). Los haces laterales discurren por el centro de cada valva y terminan en el ápice, debajo del estilo, estando ontogénicamente relacionados con la vena media de la hoja(Sessions y Zambryski, 1995).
Fig. I-7: Sección transversal de un fruto de Arabidopsis. Se muestran los distintos tejidos que
forman la zona de dehiscencia. El margen de valva, formado por la zona lignificada (LL) y la zona de separación (SL). Las valvas se han coloreado en verde y el replum en amarillo. Las células lignificadas se han coloreado en rojo.
6-2.Desarrollo floral en Arabidopsis.
La morfogénesis floral y el desarrollo del gineceo han sido descritos en detalle. Smyth et al (Smyth et al., 1990) dividieron el desarrollo temprano de la flor desde su inicio hasta antesis en 13 estadios. Este estudio ha sido usado como referencia en la descripción de numerosos mutantes y para la caracterización de numerosos genes de Arabidopsis. En Ferrándiz et al, (1999) se utiliza esta división para detallar los principales eventos del desarrollo floral junto a observaciones adicionales de diversos autores. En la Tabla I-1 se describen los principales eventos del desarrollo floral con los marcadores que caracterizan el inicio de cada estadio y el progreso del desarrollo del gineceo.
Tabla I-1. Etapas del desarrollo floral en Arabidopsis, con los marcadores morfológicos que caracterizan el inicio de cada estadio y el progreso del desarrollo del gineceo. Modificado a partir de Ferrándiz et al. (1999).
Estadio Marcador morfológico Desarrollo del gineceo 1 Aparición del meristemo floral.
2 Formación del primordio de la flor y separación del meristemo de inflorescencia. 3 Aparición de los primordios de los sépalos. 4 Los sépalos sobrepasan el meristemo floral. 5 Aparición de los primordios de los pétalos y los
estambres.
6 Los sépalos envuelven la yema floral. Aparición del primordio del gineceo.
7 Los estambres desarrollan un pedúnculo basal. Crecimiento del primordio del gineceo como un cilindro abierto. 8 Aparición de lóculos en los estambres. Aparición de la placenta. Diferenciación de los haces vasculares principales 9 Los pétalos desarrollan un pedúnculo basal.
Aparición de los primordios de los óvulos. Diferenciación de las capas de los carpelos. Aparición de los haces vasculares laterales
10 Los pétalos se igualan con los estambres cortos. Cierre del gineceo. Formación del septo. 11 Aparición de las papilas estigmáticas.
Diferenciación de la epidermis del estilo y las dos capas del endocarpo. Ramificación del haz vascular principal en el extremo del gineceo. Los óvulos desarrollan el funículo.
12 Los pétalos se igualan con los estambres largos. Crecimiento general. Diferenciación del tracto transmisor.
13 Antesis. Polinización.
14 Los estambres largos sobrepasan el estigma. Fertilización. Suturas visibles a ambos lados del replum.
15 El estigma sobrepasa los estambres largos. Lignificación del xilema. 16 Degeneración de pétalos y sépalos. Expansión general. 17A Caen los órganos de los tres verticilos externos de la flor.
Formación de la zona de separación (SL). Desarrollo de la cutícula externa del exocarpo; las células del endocarpo b (enb) forman el esclerénquima.
17B La silicua alcanza su tamaño final. Lignificación del enb y la LL.
18 La silicua amarillea. Degeneración del ena y lignificación total del enb. El mesocarpo se seca. 19 Dehiscencia de las valvas.
En la figura I-8 se muestran los distintos estadios de desarrollo del gineceo. Adaptado de (Roeder, 2005).
Fig. I-8: Estadios de desarrollo del gineceo de Arabidopsis. Se muestran micrografías electrónicas de barrido, cortes histológicos, fotografías in vivo y fotografías en campo oscuro de los distintos estadios de desarrollo del gineceo de Arabidopsis con los marcadores morfológicos que caracterizan el inicio de cada estadio. Modificado a partir de Roeder (2005).
7. FACTORES GENÉTICOS QUE CONTROLAN EL DESARROLLO DEL