aCentro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. CIDCA,
CONICET -UNLP. 47 y 116 (1900) La Plata, Argentina
bCátedra de Microbiología General. Facultad de Cs. Exactas, UNLP,La Plata,
Argentina.
cArea Bioquímica y Control de Alimentos. Facultad de Cs. Exactas, UNLP, La
Plata, Argentina.
*Autor Responsable: [email protected]
Resumen
El interés en la aplicación de microorganismos seguros aislados de ambientes naturales en la preservación de alimentos ha aumentado en los últimos años. El empleo de métodos combinados que incluyan bacterias ácido lácticas y sus productos metabólicos puede contribuir a incrementar la vida útil de los alimentos sin perjudicar su calidad nutricional. Las bacteriocinas han sido ampliam ente reconocidas como preservadores naturales de alimentos. Las mismas pueden sintetizarse in situ durante la fermentación del producto o bien adicionarse al producto.
Actualmente el concepto de biopreservación se amplia a la aplicación de bacteriofagos como agentes de control y al uso de películas comestibles. Estas prácticas han sido consideradas en los últimos años como alternativas promisorias para la preservación de alimentos.
Palabras clave: biopreservación - bacterias ácido lacticas - bacteriocinas- películas
comestibles - bacteriofagos en biopreservación
BIOPRESERVACIÓN DE ALIMENTOS
En las últimas décadas surge la demanda de productos naturales de alta calidad que garanticen ser seguros e inocuos para la salud. Los alimentos naturales o tradicionales, procesados sin aditivos químicos, se transforman en alimentos cada
vez más atractivos para los consumidores. Los nuevos procesos de manufactura y el aumento de la demanda de alimentos minimamente procesados, requieren el desarrollo de nuevas estrategias para prolongar de manera natural la vida útil de los alimentos. La biopreservación, es decir, la preservación de alimentos empleando sustancias naturales constituye una alternativa para aumentar la vida útil, mejorar la calidad higiénica y minimizar el impacto sobre las propiedades organolépticas y nutricionales de los alimentos perecederos. La biopreservación aprovecha el potencial antimicrobiano natural presente en los microorganismos con una larga historia de uso seguro o sus metabolitos [1].
A continuación se tratan aspectos generales de aplicación de bacterias ácido lácticas y sus metabolitos, así como también el uso de bacteriofagos y películas comestibles en la preservación de alimentos.
LAS BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS EN LA CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
El uso empírico de los microorganismos y/o sus productos naturales para la conservación de los alimentos ha sido una práctica común en la historia de la humanidad [2]. Las bacterias ácido lácticas (BAL) se emplearon para la fermentación de la leche, vegetales o carnes desde la antigüedad como método artesanal para obtener derivados con mayor vida útil.
Las bacterias del ácido láctico producen una gran variedad de sustancias antimicrobianas, tales como ácidos orgánicos, etanol, diacetilo, peróxido de hidrógeno, reuterina, reutericiclina, dipéptidos antifúngicos y bacteriocinas [3-7].
El interés por el uso de BAL en la preservación de alimentos se ha incrementado en los últimos años cuando algunos estudios revelaron la actividad antagónica que poseen algunos microorganismos contra la acción de distintos patógenos y contaminantes. Diversas bacterias lácticas han sido citadas por su capacidad de inhibir bacterias patógenas, ejemplo de ellas son: Lb. acidophilus [8], Lb. gasseri [9], Lb. rhamnosus [10], Lb. plantarum [11, 12], Lb. casei [13], Lb. paracasei [14]. El efecto antibacteriano de ciertos lactobacilos y bifidobacterias ha sido extensamente estudiado en interacciones
in vitro contra bacterias enteropatógenas gram negativas, tales como, Escherichia coli
patogénicas [9, 13, 15], Salmonella entérica [14, 16-18], Shigella sonnei [19] y
Helicobacter pylori [20]. El efecto antagónico de bacterias lácticas contra patógenos
gram positivos se ha descripto especialmente en interacciones Listeria monocytogenes [21] y Bacillus cereus [22].
PRODUCCIÓN DE SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS POR BAL
El uso de sustancias antimicrobianas producidas por BAL ofrece aplicaciones en la industria alimentaria que pueden contribuir a reducir la adición de conservantes químicos y la intensidad de los tratamientos térmicos, lo que permite obtener alimentos
conservados de manera natural, con mejores características organolépticas y propiedades nutricionales. Esto representa una alternativa para satisfacer la creciente demanda de los consumidores de alimentos seguros, con sabor fresco, minimamente procesados y listos para el consumo.
Los ácidos orgánicos, fundamentalmente el ácido láctico y el ácido acético, han sido históricamente los metabolitos producidos por BAL más empleados como conservantes por ser saludables para el medio ambiente, naturales y generalmente reconocidos como seguros.
Se ha propuesto que las formas protonadas de estos ácidos inhiben el crecimiento de células bacterianas y fúngicas [23, 24], mediante diversos mecanismos tales como inhibición enzimática [25], modificación de la osmolaridad, inhibición del crecimiento celular [26-27] e interrupción del transporte activo [28]. Dentro de las aplicaciones de ácidos orgánicos en la preservación de distintos alimentos se ha descripto su aplicación a carne fresca para inhibir bacterias patógenas [29]. Estudios sobre la aceptabilidad sensorial de carnes tratadas con ácidos orgánicos indican que su aplicación en concentraciones menores a 2 % no afecta su color [30-31]. Sin embargo, distintos autores reconocen que bajo ciertas condiciones de aplicación, pueden ocasionar una decoloración de la carne [32-35]. Choi y col. hallaron una reducción significativa de los niveles de Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium y Escherichia coli O157:H7 esparcidos sobre rodajas de carne de cerdo luego del tratamiento con ácido láctico y con ácido acético en concentraciones 1 % a 3 % [36]. Birk y col., hallaron que la aplicación de distintos ácidos orgánicos en concentración 0.5 % reduce la población de Campylobacter jejuni en carne de pollo entre 4 y 6 unidades logarítmicas en 24 horas, sin afectar las características organolépticas del producto [37]. Muchos otros estudios han probado la eficacia de los ácidos orgánicos en la reducción de patógenos contaminantes de carne [38-41], sin embargo, existen pocos datos acerca de su eficacia y a pesar de su aprobación regulatoria, su uso no es ampliamente aceptado en la práctica comercial [42-43].
Existe evidencia de que la leche en polvo puede contener esporos de Bacillus cereus [44-45]. Dada esta condición, la germinación de esporos de B. cereus en la leche reconstituida para su consumo puede ocasionar la liberación de exotoxinas que producen intoxicación alimentaria. Una serie de estudios han demostrado que Lb. casei y Lb. acidophilus son capaces de inhibir la germinación y el crecimiento de B. cereus en leche [46-48]. Al fermentar leche en polvo con gránulos de kefir se pudo comprobar que los microorganismos del fermento y/o sus metabolitos fueron capaces de inhibir la germinación de esporos de B. cereus adicionados en concentración conocida antes de la fermentación. Este resultado coincide con un rápido descenso del pH indicando la función relevante de los ácidos orgánicos [49].
El interés de la biopreservación en panificación se debe fundamentalmente a los reducidos niveles de conservantes químicos admitidos para productos panificados tales
como sales de propionato y sorbato que son permitidos en concentraciones de 0.3 y 0.2 % (p/v) respectivamente (Directiva UE 95/2/CE). Las BAL pueden ser agregadas a la masa como cultivos iniciadores. Las mismas extienden la vida útil del producto al sintetizar metabolitos antimicrobianos y además, contribuyen a sus propiedades tecnológicas, nutricionales e influencian su aroma [50-55]. Entre los metabolitos antimicrobianos producidos por BAL los ácidos láctico, propiónico, acético, fenil- láctico y p-hidroxi-fenil láctico han demostrado tener un potente efecto inhibitorio sobre hongos y bacterias que deterioran el pan [56-60]. El producto formado al fermentar la masa con Lb. plantarum, conteniendo estos ácidos orgánicos, ha demostrado ser tan efectivo como el propionato de calcio 0.3 % p/v en la prevención del deterioro del pan causado por B. subtilis [59]. También se han obtenido resultados prometedores en la sustitución de conservantes por ácidos orgánicos [56, 61].
Otros compuestos muy prometedores como conservantes son las bacteriocinas. Las bacteriocinas son péptidos o proteínas pequeñas con actividad antimicrobiana sobre bacterias estrechamente relacionadas con la cepa productora, mientras que las células que la producen son inmunes [50, 62-63]. Si bien las bacteriocinas son producidas por numerosas bacterias Gram-positivas y Gram-negativas [64], aquellas producidas por BAL han recibido especial atención ya que, por ser generalmente reconocidas como seguras (status GRAS), presentan potencial aplicación en la industria alimentaria.
Debido a su naturaleza hidrofóbica, las bacteriocinas actúan fundamentalmente mediante la formación de poros en las membranas. Esto ocasiona la muerte de la célula blanco debido al flujo de iones y solutos al espacio extracelular y a la disipación de la fuerza protón motriz [65]. La formación de poros por la nisina y otros lantibióticos se encuentra mediada por el lípido II [66]. Este lípido actúa estabilizando la unión de la bacteriocina a la membrana y aumentando así su eficacia a bajas concentraciones [67]. Otro mecanismo de acción de las bacteriocinas es la inhibición de la síntesis de la pared celular. Por ejemplo, la mersacidina inhibe la síntesis del peptidoglucano bloqueando la transglicosilación al formar un complejo con el lípido II [68]. El rango de efectividad de las bacteriocinas puede ser estrecho, como en el caso de las lactococcinas A, B y M que sólo inhiben Lactococcus, o extraordinariamente amplio como algunos lantibióticos tipo A (ej. nisina y mutanicina B-Ny266) que tienen efecto sobre numerosos microorganismos tales como Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium,
Enterococcus, Gardnerella, Lactococcus, Listeria, Micrococcus, Mycobacterium, Propionibacterium, Streptococcus y Staphylococcus. Se ha demostrado además que
estas bacteriocinas en particular son también activas contra algunas bacterias Gram- negativas de importancia médica tales como Campylobacter, Haemophilus,
Helicobacter y Neisseria [69].
Las bacteriocinas se pueden emplear como conservantes en alimentos de dos formas: mediante la adición de la bacteriocina pura o parcialmente purificada (producción ex
caso, las bacteriocinas son obtenidas por cultivo de la cepa de productora en un fermentador a escala industrial seguido por una recuperación y procesamiento adecuado. Su utilización requiere de la aprobación específica como conservante desde el punto de vista legal. Hasta el momento, la nisina es la única bacteriocina con licencia como conservante de alimentos (E234). Las bacteriocinas producidas ex situ también pueden ser añadidas en forma de concentrados obtenidos mediante el cultivo de la cepa productora en un sustrato de calidad alimentaria (como leche o suero). Los preparados resultantes pueden considerarse ingredientes desde el punto de vista legal, ya que, además de metabolitos antimicrobianos bioprotectores, contienen componentes que pueden desempeñar una función reconocida en los alimentos, como por ejemplo aumentar el contenido proteico o presentar capacidad espesante [70]. Además de los concentrados ya comercializados, como ALTA™ 2341 y Microgard™, se han descripto recientemente otras preparaciones a base de leche tales como Lacticina 3147 [71, 72] y Variacina [73] y a base de suero como Enterocina AS-48 [74]. La producción de bacteriocinas in situ ofrece ventajas en aspectos legales y costos en comparación con la producción ex situ [75]. Muchos estudios se han centrado en la selección y desarrollo de cultivos bacteriocinogénicos para su aplicación en alimentos [76-80]. Cultivos iniciadores productores de nisina han sido específicamente diseñados para inhibir
Staphylococcus aureus en quesos ácidos y Clostridium tyrobutyricum en quesos semi-
duros [81-82]. Cultivos protectores bacteriocinogénicos, que no contribuyen a las propiedades sensoriales de los alimentos, han sido aplicados a fin de mejorar la calidad higiénica de carnes y productos a base de pescado [83].
Además de las bacteriocinas, algunas BAL producen compuestos antimicrobianos de bajo peso molecular, entre los que se incluyen la reuterina y la reutericiclina. La reuterina, compuesta por una mezcla de diferentes formas de - hidroxipropionaldehídos, es producida por Lb. reuteri y Lb. coryniformis [84]. Es activa contra microorganismos Gram positivos, Gram negativos, hongos y levaduras. Kuleaşan
y col. [85] demostraron que la adición de reuterina a la superficie de embutidos cárnicos
inhibe considerablemente el crecimiento de List. monocytogenes. Arqués y col. [86] describieron que es efectiva en la conservación de cuajada al ser aplicada en combinación con nisina y el sistema lactoperoxidasa, reduciendo notoriamente los niveles de List. monocytogenes y Staphylococcus aureus en este producto lácteo no acidificado.
La reutericiclina, un ácido tetramérico producido por cepas de Lb. reuteri, es activa contra numerosas especies de Lactobacillus, Enterococcus, Staphylococcus, Bacillus, bacterias gram-negativas entéricas, hongos y levaduras [52]. Este compuesto actúa como un ionóforo, translocando protones y disipando de esta manera el gradiente de protones transmembrana [87]. La reutericiclina es producida en concentraciones efectivas durante la fermentación de masas de trigo y permanece activa luego de la cocción [88] por lo que se ha sugerido que, bacterias productoras de reutericiclina,
podrían ser aplicadas a productos panificados a fin de inhibir microorganismos que los deterioran extendiendo así su vida útil [89].
Otro compuesto antimicrobiano producido por la mayoría de las BAL en presencia de oxígeno es el peróxido de hidrógeno (H2O2). Como estas bacterias no poseen actividad catalasa, el H2O2 se acumula en el ambiente [90]. La capacidad antimicrobiana de este compuesto se atribuye a su fuerte efecto oxidante y a la destrucción de la estructura molecular de proteínas celulares [91-92].
El diacetilo (2, 3-butanodiona) es otra sustancia con efecto antimicrobiano producida por algunos géneros de BAL durante la fermentación del citrato [93]. Este compuesto en concentraciones entre 200 y 300 μg/mL presenta efecto inhibitorio sobre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, levaduras y hongos [94]. Kang y Fung [95] propusieron su uso como ingrediente en la fermentación de carnes, hallando que en concentración de 300 ppm inhibe significativamente el crecimiento de E. coli O157:H7 y Salmonella typhimurium durante la fermentación de salame. También se ha demostrado que retarda el crecimiento de microorganismos causantes de deterioro en carne picada al ser aplicado en concentraciones inferiores a 50 μg/g [96].
ADSORCIÓN DE COMPUESTOS TÓXICOS EN LA SUPERFICIE DE BAL
Los alimentos para humanos y animales pueden contener carcinógenos naturales provenientes tanto de materias primas contaminadas como del procesamiento de éstos, como son las micotoxinas, entre ellas las aflatoxinas. Las aflatoxinas (AFs) son metabolitos secundarios de los hongos filamentosos Aspergillus flavus, Aspergillus
parasiticus y Aspergillus nomius, los cuales crecen en una gran variedad de alimentos
durante su cultivo, cosecha, almacenamiento y transporte [97-98]. Las AFs afectan la salud animal y humana debido a su efecto mutagénico, carcinogénico, teratogénico, hepatotóxico e inmunosupresor [99], siendo la aflatoxina B1 (AFB1) la más tóxica [100]. Las bacterias ácido lácticas (BAL) tiene la capacidad de adsorber sustancias carcinogénicas en su superficie, y dado su carácter GRAS, son un potencial decontaminante natural de esta toxina. Se ha encontrado que un gran número de BAL presenta la capacidad de capturar aflatoxinas [97, 101-106] y se ha estudiado que el mecanismo de captura es un fenómeno físico que tiene lugar en la superficie celular, donde los principales componentes celulares involucrados son el peptidoglicano, los polisacáridos y proteínas de la pared celular. Diferencias en el tipo, número, o disponibilidad de sitios de unión para AFB1 hace que existan variaciones en la captura de AFB1 entre cepas [97, 102, 107].
Dado que el efecto protector tiene lugar en la medida que la aflatoxina permanezca ligada al microorganismo durante todo el pasaje por el tracto gastrointestinal, se ha evaluado la capacidad de captura simulando las condiciones gastrointestinales tales como presencia de sales biliares y mucus en el medio del desafío y la estabilidad del
complejo aflatoxina- microorganismo. La captura de AFB1 por células viables de Lb.
rhamnosus GG y Lb. rhamnosus LC 705, en condiciones de pH similar al
correspondiente al tracto intestinal (2.5 a 8.5), liberan sólo un 10 % de la aflatoxina capturada [102]. Hernández-Mendoza y col. [108] han demostrado que diferentes cepas de Lb. casei provenientes de ensilados, heces humanas, quesos y bebidas fermentadas capturan aflatoxina AFB1 y son capaces de retener la aflatoxina capturada tras los lavados, tanto en medio líquido como adicionado de sales biliares. Los autores demuestran que a pesar de que la bilis reduce el recuento de microorganismos viables hasta en 100 veces, el efecto sobre los componentes de membrana incrementa la unión de aflatoxinas por interacciones débiles a la superficie bacteriana en los bolsillos hidrofóbicos. Esto significa que la viabilidad de los microorganismos no es esencial para la captura de AFB1 [102, 103,106, 108].
CONSERVACIÓN DE FERMENTOS PARA SU USO EN BIOPRESERVACIÓN
El uso de cultivos con aptitudes para actuar como biopreservadores de alimentos, exige una cuidadosa selección de cepas. Si el cultivo iniciador es productor de sustancias antimicrobianas, las mismas deben alcanzar concentraciones suficientes en el alimento, considerando su procesamiento y condiciones de almacenamiento [70]. Es así que la producción comercial de cultivos lácticos iniciadores monocepa o mixtos y su uso crecieron rápidamente en la industria láctea debido a sus numerosas ventajas.
Un desafío importante cuando se habla de fermentos mixtos es la conservación del mismo a largo plazo ya que no todas las especies responden de manera similar. El uso industrial de fermentos mixtos incita a la búsqueda de técnicas de conservación que permitan mantener no sólo la viabilidad sino también las propiedades tecnológicas. Las técnicas de conservación más utilizadas son la congelación, la liofilización y el secado. La liofilización, presenta numerosas ventajas como método de deshidratación debido a las condiciones de trabajo ya que la temperatura de trabajo es baja, no hay presencia de oxígeno durante el proceso, por lo que se evita la oxidación, la humedad residual es baja, los productos son estables durante el almacenamiento por largos períodos y no necesitan cadena de frío para su distribución. To y Etzel [109] demostraron que el 60-70 % de las células que han sobrevivido al paso de la congelación sobreviven la desecación. A pesar de todas estas ventajas, suele producirse desnaturalización de proteínas y pérdida de la viabilidad de muchos tipos celulares [110]. Asimismo otros de los inconvenientes de este proceso son el alto costo de los equipos, la elevada energía empleada y el tiempo que insume el mismo. Los productos liofilizados vuelven a su estado original luego de la rehidratación. Es un método apropiado para conservar microorganismos, muy utilizado para cultivos iniciadores de aplicación industrial y conservación de colecciones microbianas [111].
Aunque la liofilización es la alterativa más utilizada actualmente para deshidratar microorganismos, cuando se piensa en una producción de cultivos a gran escala, la liofilización resulta muy costosa y de bajo rendimiento y, en estos casos, el secado por atomización ofrece una alternativa más efectiva y rápida [112]. El secado por atomización además de emplearse para la producción de leche en polvo, bebidas deshidratadas, café instantáneo y té, entre otros productos alimenticios, es un proceso muy utilizado y con muchas ventajas para la producción de deshidratados conteniendo microorganismos. Esta metodología se ha empleado para deshidratar y conservar bacterias lácticas para ser usadas como cultivos iniciadores (para yogurt o queso), cultivos productores de bacteriocinas y cultivos probióticos [112-113]. Las ventajas de esta tecnología es que se pueden producir grandes cantidades de producto deshidratado a bajo costo, estos productos pueden ser transportados fácilmente y almacenados por largos períodos de forma estable [114-116]. Durante el proceso de secado por atomización un líquido es atomizado en forma de gotas dentro de una cámara y transformado en “polvo” por acción del calor. De esta forma, las pequeñas gotas líquidas de una suspensión de bacterias se arrastran y deshidratan en una corriente de aire caliente dando un polvo seco. Por lo tanto, durante este proceso los microorganismos están expuestos a altas temperaturas por breves períodos, lo que puede causar daño en la célula, pérdida de viabilidad durante el proceso o durante el posterior almacenamiento de los productos deshidratados [115-118]. La supervivencia y la viabilidad del microorganismo durante el secado por atomización va a depender de muchas variables, entre ellas podemos nombrar: tipo de cepa y tolerancia intrínseca al stress, medio de suspensión, temperatura de secado, tiempo de exposición del microorganismo al calor (velocidad de flujo), actividad de agua/humedad del deshidratado, temperatura y condiciones del almacenamiento (humedad, oxígeno, luz) [112]. Por lo tanto, para tener éxito en la conservación de un microorganismo por secado por atomización es necesario evaluar estas variables y encontrar las mejores condiciones en donde la supervivencia sea máxima y el daño sea mínimo.
Pese a las limitaciones y desventajas comentadas anteriormente, existen numerosos trabajos donde se demuestra la aplicabilidad del secado por atomización para bacterias lácticas sin grandes pérdidas de viabilidad y funcionalidad, o al menos, pérdidas comparables con las que ocurren durante la liofilización [119-120]. Teixeira y col. [114]