Funcionalidad de probióticos y producción del cultivo

El primer paso en la producción de un cultivo probiótico para su empleo a gran escala implica su desarrollo en un medio de cultivo adecuado para la obtención de biomasa. En este sentido, las variables involucradas durante el crecimiento de l a cepa (pH del medio, tipo y concentración de carbohidratos, fase de crecimiento, estado celular, etc.) pueden afectar significativamente tanto su resistencia a barreras biológicas como su capacidad de interacción con células inmunes, condicionando así su funcionalidad.

Durante el crecimiento en medio líquido de Bifidobacterium animalis subsp.

lactis INL1, una cepa aislada de leche materna [14], en un biorreactor a 37 ºC en

caldo MRS, se observó que el cultivo llega a fase estacionaria más rápid amente cuando se cultiva a pH 6.5, en comparación con un cultivo desarrollado a pH 5.0. Sin embargo, cuando la cepa fue sometida a un ensayo de resistencia gástrica (pH 2.0, 0.3 % pepsina, 37 ºC, 90 min), se observaron 4 órdenes logarítmicos de muerte celular para el cultivo desarrollado a pH 6.5, mientras que la pérdida de viabilidad fue despreciable durante el ensayo de resistencia gástrica para el cultivo obtenido a pH 5.0. Adicionalmente, los estudios de microscopía electrónica evidenciaron en el

cultivo desarrollado a pH 6.5 la producción de un tipo de compuesto extracelular, para el cual se debe estudiar aún su influencia sobre la respuesta in vivo. En el cultivo a pH 5.0 no se detectaron compuestos de esta naturaleza (datos no mostrados).

En relación al pH del medio de cultivo, Saarela y col. [15] estudiaron la resistencia a la acidez gástrica y a bilis de una cepa de Lb. rhamnosus desarrollada a pH 5.0 y 5.8 y liofilizada en polidextrosa y sacarosa. Los autores observaron que el cultivo obtenido a pH 5.0 presentó una mayor resistencia a la acidez gástrica que el desarrollado a pH 5.8, aunque estas diferencias sólo se observaron para los cultivos liofilizados en polidextrosa pero no para los cultivos liofilizados en sacarosa como crioprotector. En este estudio, se puso de manifiesto no sólo la importancia del pH del medio de cultivo utilizado para la producción de biomasa en la resistencia gástrica sino, además, la influencia del crioprotector utilizado en la viabilidad y resistencia gástrica de la biomasa producida . Para ambos pH ensayados como para los dos crioprotectores empleados, el cultivo de Lb.

rhamnosus demostró igual estabilidad cuando fue conservado a 37 ºC durante 2

semanas, mientras que la resistencia gástrica y a sales biliares fueron significativamente afectadas, lo que demuestra la utilidad de estos ensayos como monitores de funcionalidad.

El momento de la fase de crecimiento en el cual se realiza la cosecha de células del cultivo probiótico en desarrollo es otra variable que condiciona la funcionalidad de la cepa. En nuestro laboratorio observamos que la resistencia gástrica de la cepa B. animalis subsp. lactis INL1 luego de 22 h de cultivo (fase estacionaria tardía) en un biorreactor a 37 ºC con inyección de CO2 presentó una resistencia gástrica significativamente mayor que el mismo cultivo cosechado a las 12 h, cuando se encontraba en fase estacionaria temprana (datos no publicados). Sashihara y col. [16] demostraron que la capacidad de una cepa de Lb. gasseri de inducir la síntesis de la citoquina proinflamatoria IL-12 en co-cultivo con esplenocitos de ratón es dependiente de la fase de crecimiento de la cepa, siendo esta capacidad máxima una vez que la cepa se encuentra en fase exponencial tardía. Maassen y col. [17] estudiaron el efecto de la administración oral a ratones de cepas probióticas de Lb. reuteri, Lb. murines, Lb. casei y Lb. plantarum, en fase de crecimiento logarítmica o estacionaria, sobre la relación de subclases de inmunoglobulinas IgG1/IgG2a, como reflejo del cambio de una respuesta TH2 a TH1 o viceversa. Estos autores observaron que sólo para algunas cepas, el momento en el cual se realiza la cosecha celular es capaz de incidir sobre la respuesta de la misma in vivo. Estas diferencias en la respuesta podrían resultar como consecuencia de la diferente composición de la pared celular entre los aislamientos realizados en diferentes momentos de la curva de desarrollo, principalmente debido a la síntesis de proteínas de estrés ( heat shock proteins) de

naturaleza proinflamatoria [18, 19, 20]. A similares conclusiones arribaron Haller y

col. [21], quienes reportaron una mayor síntesis de la citoquina proinflamatoria

TNF alfa por parte de monocitos en co-cultivo con cepas de bacterias lácticas obtenidas en fase estacionaria, en relación a lo observado en fase exponencial.

El estado fisiológico celular de una cepa es otra de las variables involucradas en sus propiedades funcionales. Como ejemplo de tal efecto se puede mencionar el trabajo de Lepercq y col. [22], en el que se evaluó la capacidad de una cepa de B.

animalis para hidrolizar, in vivo, sales biliares durante su tránsito en el intestino de

cerdos. En este caso, la actividad de la hidrolasa de sales biliares resultó mayor para células viables cultivadas en la fase de crecimiento exponenc ial, cuando se la compara con la obtenida para células en fase estacionaria o con células no viables. Más recientemente, se observó [23] que la actividad inmunomoduladora, evaluada como producción de IL-12, de una cepa de Lact. lactis se modifica de acuerdo al estado fisiológico celular (células viables o no) y, a su vez, en función del medio de cultivo utilizado para su desarrollo (M17 adicionado de glucosa o MRS). Asimismo, detectaron diferencias en la composición de azúcares de pared y el contenido de ácidos grasos de las células desarrolladas en ambos medios, determinantes de las variaciones observadas en la actividad inmunomoduladora y, por ende, en la funcionalidad de la cepa. En este caso se comprobó que la composición del medio de cultivo es otra de las variables que pueden afectar, en mayor o menor medida, las propiedades funcionales de una cepa probiótica. En este sentido, se demostró [24] que el lactitol mejora la tolerancia a bilis así como la estabilidad al almacenamiento en frío, de una cepa de Lb. salivarius, en relación a los valores detectados cuando la misma desarrolla en presencia de otras fuentes de carbono.