1) Toma de muestra y preparación de las diluciones
Utilizar frascos estériles de capacidad adecuada para la cantidad de agua necesaria para realizar los análisis. Si se supone la presencia de cloro o cloraminas en el agua, agregar 100 mg de tiosulfato de sodio por litro de muestra en los frascos antes de su esterilización. Si pudieran hallarse presentes metales pesados proceder de igual forma empleando 572 mg de EDTA por litro de muestra. Realizar diluciones decimales sucesivas empleando como diluyente agua peptona 0,1% (9060. St. Meth. 18th Ed. 1992).
2) Metodología de análisis
a) Recuento total de bacterias aerobias mesófilas b) Recuento de coliformes totales
c) Determinación de coliformes totales por el método de filtración por membrana d) Determinación de E. coli por el método de filtración por membrana
e) Determinación de Estreptococos fecales f) Determinación de P. aeruginosa
g) Determinación de anaerobios esporulados sulfito reductores a) Recuento total de bacterias aerobias mesófilas
Sembrar en Agar para Recuento en Placa (APC). En la mayoría de las aguas potables los recuentos adecuados se logran sembrando 1 y 0,1 ml del agua tal cual y 1 y 0,1ml de la dilución 1/100. Realizar como mínimo dos placas por dilución de diluciones sucesivas.
Incubar a 37oC por 24hs. Informar UFC de aerobios mesófilos/ml (9215. St. Meth. 18th. Ed.
1992).
b) Recuento de coliformes totales
A) Ensayo presuntivo
A1 - Determinación de coliformes totales por la técnica de fermentación en tubos múltiples
(NMP)
Se inoculan series de 5 tubos de por lo menos 3 diluciones decimales sucesivas (generalmente 10, 1 y 0,1 ml). Si el inóculo es igual o mayor a 10 ml se utiliza el medio de concentración
adecuada para no diluir los nutrientes. Se incuban 24-48 h a 35oC.
A2 - Determinación de coliformes totales por ensayo de Ausencia-Presencia
Sembrar la cantidad adecuada de agua en frascos con igual volumen de Caldo Lauril Sulfato de doble concentración. Incubar 24-48 h a 35ºC. Producción de gas y/o ácido y/o crecimiento abundante se confirman como en (1). Se informa ausencia o presencia de coliformes totales en el volumen de agua sembrada.
(1) - Ensayo de confirmación:
Los tubos o frascos que producen gas y/o crecimiento abundante en A1 y en A2 se transfieren
con ansa a tubos de fermentación de Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa. Se incuban 48 h a
35oC. Los tubos que producen ácido en (1) se computan para el cálculo del NMP. En el caso
de que en A1 fueran positivos todos los tubos de dos diluciones consecutivas se confirman
Esquema del método 9221. Standard Methods 18th. Ed. 1992.
(1) (a) - Ensayo completo:
Para establecer con certeza la presencia de coliformes y para obtener datos de control de calidad se debe usar el Ensayo Completo en por lo menos el 10% de los tubos positivos en los ensayos anteriores. Se puede utilizar una doble confirmación en Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa o sembrar cada tubo positivo de (1) en Agar Endo o Agar Mac Conkey. Incubar 24 h a 35ºC. Las colonias típicas en Agar Endo son rosas o rojas con brillo metálico y las atípicas son rosas o rojas sin brillo metálico, otras colonias se consideran negativas. Las colonias típicas en Agar Mac Conkey son rojas rodeadas de un halo de precipitación.
De cada placa se pica una o más colonias y se transfieren: a.1.1. Caldo Lauril Sulfato. Incubar 24-48 h a 35ºC.
a.1.2. Agar Nutritivo inclinado (No necesario en agua de bebida). Incubar 24 h a 35ºC.
La producción de gas en Lauril Sulfato y la presencia de cocobacilos Gram - en el cultivo de Agar Nutritivo indican: Presencia del grupo coliforme (Ensayo completo).
Si no se produce gas en los tubos de Caldo Lauril Sulfato, ajustar el cálculo del NMP.
Inocular tubos de fermentación para NMP (A1) o
frascos para Ensayo de Ausencia-Presencia (A2)
con Caldo Lauril Sulfato. Incubar por 24 h a 35ºC.
Crecimiento con producción de ácido y/o gas +. Transferir para confirmación a Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa. Incubar 48 h a 35ºC.
Producción de ácido y/o gas -. Incubar 24 h más (48 h en total).
(1) (2)
Producción de gas +. Transferir a Agar ENDO o Mac Conkey. Incubar 24 h a 35ºC. Producción de gas -. Ausencia de coliformes (a) (b) Producción de gas + y/o ácido +. Seguir como en (1).
Gas -, ácido -.
Ausencia de coliformes
(a) (b)
Colonias típicas o atípicas.
- Transferir a Caldo Lauril Sulfato. Incubar 24-48 h a 35ºC.
- Transferir a Agar nutritivo inclinado. Incubar 24 h a 35ºC a 1.2.
(1.1)
Gas +
Tinción de Gram del AN: Producción de gas -. Ausencia de coliformes (a’) (b’) Bacilos Gram – Ensayo completo Presencia de coliformes Mezcla de bacilos Gram – y Gram +. Repetir desde 1.1.
Esporas y/o bacilos Gram +. Ensayo completo
Ausencia de coliformes
Colonias no típicas.
Ausencia de coliformes
c) Determinación de coliformes totales por el método de filtración por membrana
(Directiva 95/131 CEE)
Se filtra por membrana la cantidad necesaria de agua y se coloca el filtro en 25 ml de Caldo
Lauril Sulfato. Se incuba 4 h a 30oC y 14 h a 37oC. Si hay producción de ácido y/o gas y/o
crecimiento abundante, confirmar como en (1). Se determina ausencia o presencia del grupo coliforme en el volumen filtrado.
Si se desea hacer recuento colocar el filtro sobre un pad estéril embebido en el medio de cultivo (Caldo Lauril Sulfato para filtración por membrana), incubando de igual forma. Las colonias amarillas se confirman como en (1). Se pueden determinar UFC de coliformes totales/volumen de agua.
d) Determinación de E. coli por el método de filtración por membrana
Proceder como en 4) e incubar 4 h a 30oC y 14 h a 44oC (Directiva 95/131 CEE).
Producción de ácido y/o gas y/o crecimiento abundante se confirma estriando en agar Endo. A las colonias aisladas se les realizan las pruebas de IMViC y/o set de pruebas múltiples. Se informa ausencia o presencia de E. coli en el volumen filtrado (9225 E. St. Meth. 18th Ed. 1992). Si se desea hacer recuento se procede como en 4), incubando 4 h a 30ºC y 14 h a 44ºC. Las colonias amarillas se confirman por pruebas de IMViC y/o set de pruebas múltiples. Se informa UFC de E. coli por volumen de agua filtrada.
e) Determinación de Estreptococos fecales (Método APHA 1984)
Filtrar por membrana la cantidad necesaria de agua y colocar el filtro en cajas de Agar KF. Incubar 48 h a 37ºC.
Confirmación: Aislar las colonias típicas en placas de Agar Cerebro Corazón. Incubar 24 h a 35ºC.
De las colonias aisladas realizar: Gram, catalasa, siembra en Agar Bilis Esculina (48 h a 35ºC), siembra en Agar Infusión de Corazón (24 h a 35ºC), siembra en Caldo Infusión de Corazón 6,5% de NaCl (24 h a 37ºC).
Informar ausencia o presencia de Estreptococos fecales en el volumen filtrado.
f) Determinación de P. aeruginosa (Norma DIN 38411)
Enriquecimiento:
a) Filtrar por membrana la cantidad adecuada de agua y colocar el filtro en 25 ml de Caldo Verde de Malaquita.
b) Colocar la cantidad adecuada de agua en igual volumen de Caldo Verde de Malaquita doble concentrado.
Incubar 48 h a 37oC.
Aislamiento: Si se observa crecimiento en el caldo de enriquecimiento sembrar por estría en
placas de Agar Cetrimida. Incubar 48 h a 42oC.
Confirmación: de las colonias de Agar Cetrimida sembrar en:
Agar F (formación de fluoresceína), Agar P (formación de piocianina) y Agar Acetamida. Realizar la prueba de oxidasa.
g) Determinación de anaerobios esporulados sulfito reductores (Norma DIN 38411)
Se siembra la cantidad adecuada de agua en igual cantidad de Caldo Diferencial para Clostridios (DRCM) doble concentrado. Se recubre con parafina líquida y se pasteuriza el conjunto 20 minutos a 70ºC. Se incuba como mínimo 48 h a 37ºC. La mayoría de los cultivos pueden reconocerse al cabo de 3-4 días pero es conveniente prolongar las observaciones una semana o más, ya que la germinación de las esporas puede tardar bastante tiempo.