Microbiología de
Alimentos
Dpto. Química Orgánica
CURSO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS
Tema Página Enterococos 3 Estafilococos 4 Enterobacterias 5 Bacterias esporuladas 11 Bacillus 11 Clostridium 12
Clasificación e identificación de hongos y levaduras 14
Análisis de micotoxinas en alimentos 16
Análisis de leche fluida 19
Análisis de leche en polvo 24
Análisis de mantecas y margarinas 31
Análisis de helados 38
Análisis de conservas 43
Recuento de filamentos de hongos en conservas. Cámara de Howard 48
Análisis de azúcar 50
Análisis de carnes y productos cárnicos 53
Análisis de alimentos deshidratados 68
Análisis de agua 72
Tablas de NMP 76
Bibliografía 79
Anexo - Bioseguridad 80
ENTEROCOCOS
-Objetivos:
-Introducción de los medios de cultivo y pruebas bioquímicas características de Enterococcus
faecalis. Pruebas bioquímicas diferenciales de otras bacterias relacionadas. - Análisis de las cepas
1) Realizar la tinción de Gram.
2) Prueba de la Catalasa: Se emulsiona un ansa de cultivo en una gota de H2O2 10% sobre
portaobjetos. La efervescencia causada por la liberación de O2 indica la presencia de catalasa.
3) Sembrar en caldo infusión cerebro corazón o caldo glucosa e incubar a 10, 37, y 45ºC durante 48 h.
4) Sembrar en caldo infusión cerebro corazón o caldo glucosa a pH 9,6 e incubar a 37°C durante 48 h.
5) Sembrar en caldo infusión cerebro corazón o caldo glucosa al 6.5 % de NaCl e incubar a 37°C durante 48 h.
6) Sembrar en KF Streptococcus agar. Para observar la selectividad del medio estriar sobre una mitad de la placa una cepa conocida no Enterococcus y en la otra mitad la cepa de
Enterococcus a investigar. Incubar a 37°C, 48 h. Las colonias típicas son pequeñas de color
rojo y el medio alrededor de las mismas vira al amarillo.
7) Sembrar en agar bilis-esculina. Incubar a 37ºC, 48 h. Las colonias típicas son pequeñas y oscuras y el medio alrededor queda oscurecido.
ESTAFILOCOCOS
-Objetivos:
-Introducción de los medios de cultivo y pruebas bioquímicas características de
Staphylococcus aureus. Pruebas bioquímicas diferenciales de otras bacterias relacionadas. - Análisis de las cepas
1) Realizar la tinción de Gram.
2) Prueba de la Catalasa: Se emulsiona un ansa de cultivo en una gota de H2O2 10% sobre
portaobjetos. La efervescencia causada por la liberación de O2 indica la presencia de catalasa.
3) Sembrar por estría en agar manita (Medio110 para estafilococos) dos cepas de
Staphylococcus sp. con distintas propiedades bioquímicas. Incubar a 37ºC, 48 h. Revelar con
solución saturada de sulfato de amonio o con HCl diluido para evidenciar la gelatinólisis. Revelar con púrpura de bromocresol para la fermentación del manitol.
4) Sembrar en el medio Baird-Parker por estría dos cepas de Staphylococcus sp. Incubar a 37ºC, 48 h. Las colonias típicas de S. aureus son circulares, suaves, convexas, de 2 a 3 mm de diámetro en placas poco crecidas, de grises a negras, rodeadas de un halo opaco y, frecuentemente de un halo claro más externo. Ocasionalmente se encuentran cepas no lipolíticas que no presentan halos. La apariencia puede ser seca y el color menos intenso si proviene de un alimento congelado o desecado.
5) Prueba de la Coagulasa: Colocar 0,5 ml de plasma, de conejo o humano, citratado, diluido en solución fisiológica, en un tubo de ensayo pequeño. Agregar un ansa de cultivo e incubar a 37°C. La aparición de grumos o coágulos en el término de 1 a 4 horas indica que la cepa es coagulasa (+). Paralelamente hacer un blanco sin sembrar y un testigo con cepa de estafilococo coagulasa (+).
6) Prueba de la Termonucleasa: Las placas de Baird-Parker en las que se observan colonias típicas se colocan en estufa de 60°C durante 2 hs para inactivar las nucleasas termosensibles. Luego de la inactivación verter en cada placa 10 ml de TDA (agar con ADN y azul de toluidina) fundido. Incubar a 37°C durante 2 a 4 horas. La hidrólisis del DNA se evidencia por la aparición de halos claros alrededor de las colonias.
7) Fermentación de manitol en anaerobiosis
ENTEROBACTERIAS
- Objetivos
-Reconocimiento de los grupos de microorganismos marcadores y patógenos más importantes dentro de los miembros de esta familia.
-Introducción de los medios de cultivo y pruebas bioquímicas características de estos microorganismos.
-Aplicación de técnicas serológicas para la identificación de Salmonella. - Análisis de las cepas
MARCADORES
1) Familia Enterobacteriaceae
Se trabajará con una cepa de enterobacteria y otra no enterobacteria.
a) Siembra en agar de aislamiento por la técnica de vertido en placa. Observación de colonias típicas.
- Con cada una de las cepas 1), a partir de una suspensión bacteriana sembrar 1 ml en una placa de Petri y volcar agar Bilis Rojo Violeta Glucosa (ABRV-G), fundido y mantenido a 44-46ºC. Homogeneizar rotando la placa. Confeccionar una sobrecapa de aproximadamente 10 ml del mismo medio fundido, mantenido a 44-46°C. Dejar solidificar. Incubar las placas en posición invertida a 35-37°C durante 21+3 h. Observar las colonias. Se consideran
presuntas unidades formadoras de colonias de enterobacterias las colonias de color púrpura con halo de precipitación.
b) Confirmación de colonias típicas. Características morfológicas y pruebas bioquímicas. - Transferir una colonia típica de cada una de las placas a tubos de caldo glucosa y agar nutritivo. Incubar a 35-37 °C durante 21+3 h.
- A partir del cultivo, realizar tinción de Gram. Observar al microscopio. - A partir del agar inclinado realizar la prueba de la oxidasa.
- Observar la fermentación de glucosa por viraje del indicador ácido base.
Las colonias presuntivas que resulten bacilo-cocos Gram negativos no esporulados,
oxidasa negativas y fermentadoras de glucosa confirman la presencia de Enterobacteriaceae.
2) Coliformes totales
Se trabajará con una cepa de coliformes y otra no coliforme.
a) Siembra en medio líquido (caldo de fermentación). Observación de reacción característica. Confirmación en medio sólido EMB, colonias típicas de coliformes totales.
- Con cada cepa 2) sembrar 1 tubo de fermentación de caldo Lactosa-Verde Brillante-2% sales biliares, con campanitas Durham. Incubar 35-37°C durante 48 h. Se considera reacción positiva la producción de gas en la campanita de Durham.
- Confirmación.
A partir de los tubos positivos, estriar una placa de agar EMB (Eosina Azul de Metileno) según Levine. Incubar 24 h a 35-37°C.
Colonias metálicas, rosadas/rojas o de apariencia mucosa confirman la presencia de coliformes totales.
b) Siembra en medio sólido ABRV-L (agar Bilis-Rojo-Violeta-Lactosa). Observación de colonias típicas. Confirmación en medio líquido (caldo de fermentación), reacción positiva característica de coliformes totales.
- Con cada una de las cepas 2), a partir de una suspensión bacteriana, sembrar por vertido en placa 1 ml en una placa de Petri y volcar agar ABRV-L fundido y mantenido a 44-46°C. Dejar solidificar y cubrir con sobrecapa de aproximadamente 10 ml del mismo medio fundido y mantenido a 44-46°C. Dejar solidificar. Incubar las placas invertidas 24 h a 35-37°C.
Colonias de color rojo oscuro con halo de precipitación de sales biliares no menor de 0,5 mm se consideran presuntas unidades formadoras de colonias de coliformes.
- Confirmación.
Sembrar colonias típicas del ABRV-L en tubos de fermentación de caldo Lactosa-Verde Brillante-2% sales biliares, con campanitas de Durham. Incubar uno a 35-37°C. La
producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes totales. 3) Coliformes a 45°C (coliformes fecales)
A partir de los tubos positivos 2) a), inocular un tubo de fermentación de caldo EC. Incubar 24 h a 45°C. La producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes a
45°C.
4) Escherichia coli
Se trabajará con una cepa pura de Escherichia coli y de otra bacteria coliforme. a) Agar de aislamiento: EMB (agar eosina azul de metileno según Levine).
Sembrar ambas cepas por estría una placa de EMB según Levine. Incubar 24 h a 37°C.
Colonias con centro negro con o sin brillo metálico verde son características de Escherichia coli.
b) Características morfológicas y pruebas bioquímicas A partir de cada cepa
b.1) Realizar tinción de Gram. b.2) Prueba de oxidasa.
b.3) Inocular un tubo de caldo triptona. Incubar 24 h a 37°C.
b.4) Inocular un tubo de caldo Clark y Lubs (RMVP). Incubar 24 h a 37°C. b.5) Inocular por estría un tubo de agar Citrato Simons. Incubar 24 h a 37°C. Investigación de Indol -Técnica de Kovacs:
Agregar al cultivo de b.3) 0,2-0,3 ml de reactivo y agitar. Esperar unos minutos. Coloración roja en al parte superior del tubo indica formación de Indol (+).
Investigación de acidez - Prueba del Rojo de Metilo: Partir el cultivo de b.4) en dos alícuotas, en una de ellas agregar 5 gotas de reactivo, observar inmediatamente.
Características del indicador Rojo de Metilo: pH < 4,4 rojo
4,4 < pH < 6 rango de viraje del indicador pH > 6 amarillo
Investigación de acetil metil carbinol - Técnica de Voges-Proskauer modificada por Barrit. Sobre la otra alícuota del cultivo de b.5) agregar respetando el orden:
- 0,6ml de α- naftol al 5% y - 0,2ml de KOH al 40%
Agitar el tubo suavemente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y oxidar la acetoína (acetil metil carbinol) y permitir el desarrollo de color. Dejar descansar por lo menos 10-15 minutos.
El máximo desarrollo de color se observa luego de una hora. Color rosado en la superficie: producción de acetoína (+), VP (+). Color amarillo o cobrizo: no producción de acetoína, VP (-).
Investigación de utilización de citrato (b.5): Los microorganismos que son capaces de utilizar el citrato producen cambio de color en el medio (de verde a azul). Se considera citrato (+) el desarrollo de color azul.
Resultados típicos de Escherichia coli:
b.1) Bacilo coco Gram negativo sin esporas b.2) Oxidasa (-)
b.3) Indol (+) (algunas cepas (-))
b.4) Rojo de Metilo (+)
b.4´) Voges Proskauer (-)
b.5) Citrato (-)
PATÓGENOS Salmonella spp.
Se trabajará con una cepa pura de Salmonella spp. y de otra enterobacteria. a) Medios sólidos (agar) de aislamiento. Observación de colonias típicas. A partir de cada cepa
a) Sembrar por estría en agar Verde Brillante. b) Sembrar por estría en agar Bismuto-Sulfito.
c) Sembrar por estría en agar Desoxicolato-Citrato (Leifson) d) Sembrar por estría en agar Salmonella-Shigella.
Colonias típicas de Salmonella spp.
- Agar VB: colonias pequeñas, traslúcidas e incoloras u opacas de un color intermedio entre rosa y fucsia. El medio vira al rojo brillante.
- Agar Bismuto-Sulfito: colonias con centro negro, borde claro, precipitado negro con brillo metálico alrededor (“ojo de conejo” u “ojo de pez “).
- Agar Leifson: colonias rosa pálido hasta incoloras, de 1mm de diámetro.
- Agar Salmonella-Shigella: colonias pequeñas, entre incoloras y rosa pálido, opacas y traslúcidas. Algunas cepas dan colonias con centro negro (SFe). El medio vira al amarillo. b) Características morfológicas, pruebas bioquímicas, confirmación serológica.
A partir de cada cepa
b.1) Realizar tinción de Gram. b.2) Prueba de oxidasa.
b.3) TSI. Sembrar por punción y en superficie. Incubar a 37ºC, 24 h. b.4) LIA. Sembrar por punción y en superficie. Incubar a 37ºC, 24 h.
b.5) BAM. Sembrar por punción con ansa recta. Incubar a 37ºC, 24 h. Alternativamente se puede utilizar caldo urea.
b.6) Prueba de la β-galactosidasa: a partir de un cultivo en agar inclinado, tomar un ansa bien cargada y emulsionarla en 0,2 ml de solución salina fisiológica hasta conseguir una suspensión densa. Colocar un disco de ONPG. Incubar a 37ºC por 20 minutos. Observar hasta las 4 horas de incubación para dar un informe negativo. El color amarillo indica que la reacción es positiva.
b.7) Inocular un tubo de caldo triptona. Incubar 24 h a 37°C.
b.8) Inocular un tubo de caldo Clark y Lubs (RMVP). Incubar 24 h a 37°C.
Resultados típicos de Salmonella sp.
b.1) Bacilo coco Gram negativo sin esporas b.2) Oxidasa (-)
b.3) TSI: profundidad: amarillo o negro, con o sin ruptura del agar por formación de gas/ superficie inclinada: rojo o sin variación.
Salmonella es lactosa (-), la mayoría de las cepas y sacarosa (-), la mayoría de las cepas.
b.4) LIA: profundidad: violeta o negro (negro en la mayoría de los casos)/superficie inclinada: violeta Salmonella es lisina decarboxilasa (+)
Excepción: Salmonella paratyphi A: profundidad: amarillo superficie inclinada: violeta b.5) BAM:
- medio sin cambio de color. Salmonella es siempre ureasa (-), lac (-), la mayoría de las cepas - móvil en la mayoría de los casos
- indol (-)
- H2S (+) en la mayoría de los casos
- sin formación de gas
b.6) β-galactosidasa: (-), sin cambio de color.
b.7) Indol (-)
b.8) Voges Proskauer (-)
Identificación serológica de Salmonella sp.
Toda cepa sospechosa de Salmonella debe identificarse bioquímicamente antes de efectuar el análisis serológico. De lo contrario aglutinaciones positivas podrán ser originadas por otros gérmenes que poseen estrecha relación antigénica (Arizona, Citrobacter).
Las cepas sujetas a examen serológico deberán hallarse en su forma lisa (S), ya que en forma rugosa (R), pueden perder sus caracteres específicos dando aglutinaciones falsas.
Sueros polivalentes somáticos de Salmonella
Los sueros polivalentes somáticos son 6: OS-A, OS-B, OS-C, OS-D, OS-E, OS-F. Composición:
Los sueros OS-A y OS-B tienen las siguientes aglutininas correspondientes a los grupos antigénicos Kauffman-White que se detallan:
OS-A: OS-B:
Grupo Aglutinina___ Grupo Aglutinina___
A 1,2 y 12 B 1, 4, 5 y 12 C1 6 y 7 D1 1, 9 y 12 C2 6 y 8 D2 9 y 46 F 11 E1 3 y 10 G1 1, 13 y 22 E4 1, 3 y 19 G2 13 y 23 L 21 H 6, 14 y 24 C3 8 y 20
Cabe señalar que los sueros OS-A y OS-B permiten identificar alrededor del 98% de los serotipos más frecuentes de Salmonella.
Cuando una cepa de Salmonella (identificada previamente por sus características bioquímicas), no dé aglutinación con ninguno de los sueros polivalentes somáticos, es necesario tener en cuenta que la cepa puede:
a) presentar antígenos de envoltura V (Salmonella typhi), que inhibe la aglutinación O. b) ser un secretorio no incluido en la lista (caso muy excepcional).
Técnica:
Aglutinación somática:
-Preparación del antígeno: utilizar un cultivo de estrías de 24 h de incubación a 37°C. Suspender el crecimiento de la estría con 1ml de solución fisiológica.
-Reacción: sobre lámina de vidrio depositar una gota de c/u de los 2 sueros polivalentes somáticos y los monovalentes. Colocar al lado de cada suero, una gota de suspensión antigénica. Mezclar con un ansa previamente flameada y enfriada.
-Lectura: debe ser inmediata y no después de 5 minutos. Las reacciones tardías o dudosas no deben considerarse.
Aglutinación flagelar:
-Preparación del antígeno: a partir de una colonia de Salmonella, hacer un cultivo de 24 h en caldo. Luego agregar igual volumen de solución formolada al 5%.
-Reacción: en distintos tubos de ensayos colocar una gota de cada uno de los sueros polivalentes y monovalentes ciliares. Agregar en cada uno 0,5 ml de la suspensión antigénica.
-Lectura: se efectuará al cabo de una hora de incubación. Debe considerarse únicamente la aglutinación de tipo ciliar (flóculos esponjosos, fácilmente disociables)
Si una cepa de Salmonella (previamente confirmada por su aglutinación somática), no reacciona con ninguno de los sueros ciliares polivalentes hay que tener en cuenta que puede: a) Tratarse de una variante inmóvil
BACTERIAS ESPORULADAS Género Bacillus
- Objetivo
Observar la morfología típica de colonias de Bacillus cereus en medios usados para su aislamiento y recuento en alimentos; diferenciarlo de otras especies de Bacillus, y realizar las pruebas bioquímicas útiles para su identificación.
- Análisis de las cepas
1) Coloración de Gram: realizar la coloración según la técnica descripta en la guía de medios de cultivo. Observar forma y tinción de las células vegetativas, forma y disposición de las esporas.
2) Utilización de azúcares: sembrar una ansada del cultivo en cada uno de los tubos de caldo con azúcares (glucosa-xilosa-arabinosa-manitol). Incubar 24-48 h a 37°C. Observar la producción de ácido y/o gas.
3) Reducción de nitratos: sembrar una ansada del cultivo en caldo nitrato. Incubar 24 h a 37°C. Agregar los reactivos y observar.
4) Producción de acetoina: (VP) sembrar una ansada del cultivo en el medio VP modificado. Incubar 48 h a 37°C. Agregar los reactivos A y B y agitar. Agregar unos cristales de creatina. Leer el resultado luego de 1 h a temperatura ambiente.
5) Movilidad: inocular por punción el medio de movilidad. Incubar 24 h a 37°C. Observar crecimiento.
6) Catalasa: sembrar por estría un tubo con agar nutritivo inclinado. Incubar 24 h a 37ºC
Colocar una ansada del cultivo sobre un portaobjeto y agregar unas gotas de H2O2 al 30%.
Observar.
7) Hidrólisis de gelatina: inocular el medio por punción. Incubar 24 h a 37°C. Enfriar en heladera y observar el resultado.
8) Hidrólisis de almidón: sembrar una sola estría en agar almidón. Incubar 24 h a 37ºC. Agregar solución de lugol y observar.
9) Hidrólisis de caseína: sembrar una estría o cuatro puntos en agar leche descremada o agar caseína. Incubar 24 h a 37°C.
10) Lecitinasa: sembrar cuatro puntos en una placa de agar MYP (agar manitol-yema de huevo-polimixina). Incubar 24 h a 37ºC .Observar morfología de las colonias.
Género Clostridium - Objetivo
Observar la morfología típica de colonias de C. perfringens en medios usados para su aislamiento y recuento en alimentos; diferenciarlo de otras especies del mismo género; familiarizarse con los distintos métodos de anaerobiosis.
- Análisis de las cepas
1) Coloración de Gram: realizar la técnica descripta en la guía de reactivos y medios de cultivo. Observar forma y tinción de las células vegetativas, forma y disposición de las esporas.
2) Coloración de esporas: realizar la coloración de verde de malaquita. Observar las esporas. 3) Utilización de azúcares: sembrar 0,2 ml del cultivo en cada uno de los tubos de caldo con azúcares (glucosa- maltosa-salicina-rafinosa-etc.), sin burbujear. Incubar 48 h a 37°C. Agregar unas gotas de indicador. Observar acidez y/o gas.
4) Reducción de nitrato/movilidad: sembrar una ansada por punción en un tubo de agar semisólido de nitrato. Incubar 24 h a 37°C. Agregar unas gotas de los reactivos. Observar los resultados.
5) Hidrólisis de la gelatina: sembrar 0,2 ml del cultivo en el fondo de un tubo con agar gelatina-lactosa, sin burbujear. Incubar 24 h a 37°C. Enfriar en heladera y observar el resultado.
6) Hidrólisis de almidón: sembrar por estría en agar almidón. Incubar en anaerobiosis 24 h a 37 °C. Agregar solución de lugol y observar los resultados.
7) Leche: sembrar 0,2-0,5 ml del cultivo en un tubo con leche. Incubar 24 h a 37°C. Observar coagulación y degradación del coágulo, por digestión de caseína. Observar formación de gas. 8) Hidrólisis de caseína: sembrar por estría en agar caseína. Incubar en anaerobiosis 24 h a 37°C. Observar resultados.
9) Esporulación: sembrar 0,2 ml del cultivo en caldo Duncan-Strong al fondo y sin burbujear. Incubar 24 h a 37 °C. Realizar tinción de esporas.
10) Prueba de reducción de sulfito: inocular 0,2 ml del cultivo en agar hierro-sulfito (SPS/TSN/TSC) fundido y mantenido a 45°C. Dejar solidificar e incubar 24 h a 37°C. Observar la formación de colonias negras en el agar.
11) Lecitinasa: sembrar por estría en agar yema de huevo o similar. Incubar 24 h a 37°C. Observar precipitado alrededor de las colonias.
12) Caldo de hígado con hígado: inocular 0,2 ml del cultivo en el caldo hígado + hígado. Sellar con vaselina-parafina. Incubar 24 h a 37°C. Observar ennegrecimiento y digestión de la carne (proteólisis) o enrojecimiento (sacarólisis) y/o producción de gas.
Observaciones: los tubos con medios líquidos se cubren con vaselina o con vas-par (vaselina-parafina)
CLASIFICACION E IDENTIFICACION DE MOHOS Y LEVADURAS I. MOHOS
El estudio de los hongos se basa en las siguientes características: a) Si las hifas son tabicadas o no.
b) Si el micelio es claro u oscuro. c) Si se producen o no esporas sexuales.
d) Tipos de esporas asexuales (esporangiosporas, conidios, artrosporas, blastosporas). e) Aspecto de los esporangióforos y conidióforos: tipos de ramificación.
f) Presencia de estructuras y de esporas especiales, estolones, rizoides, clamidosporas, etc.
Plan de trabajo:
Se proveerá de distintos hongos que han crecido en un medio apropiado en tubo de ensayo y con cada uno de ellos se harán microcultivos en la siguiente forma:
a) Se recortan cuadrados pequeños de agar Czapek con una espátula estéril. b) Se colocan sobre un portaobjetos.
c) Se hacen toques en el centro de cada lado con un ansa contaminada con el hongo en estudio.
d) Se coloca encima un cubreobjetos de mayor tamaño que el trozo de agar. e) Se coloca el conjunto en una caja de Petri estéril que contiene algodón húmedo.
f) Se incuba a temperatura ambiente y se hacen observaciones periódicas a partir de las 48 h para estudiar las distintas fases de crecimiento.
II. LEVADURAS
Para identificar las levaduras deben conocerse sus características morfológicas y bioquímicas. Entre los datos morfológicos figuran aspecto del cultivo en agar extracto de malta, o en el medio de Sabouraud, tamaño y forma de las células vegetativas, formación del micelio y pseudomicelio, producción de ascosporas, tamaño y número de las mismas. Como datos bioquímicos interesa:
- habilidad para fermentar azúcares.
- utilización de fuentes de C y N para su crecimiento (método auxonográfico).
Observaciones microscópicas
Las células provenientes de medios líquidos pueden observarse directamente entre porta y cubreobjetos. Las levaduras provenientes de medios sólidos pueden observarse mejor si se las mezcla sobre el portaobjetos con una gota de nigrosina al 5% en solución acuosa. La observación al microscopio se hace por inmersión.
Coloración de esporas
Aislamiento de mohos y levaduras
En el caso de los mohos o las levaduras que se encuentran en un producto mezclados con las bacterias, para separarlos de éstas deben usarse medios de cultivo que favorezcan el desarrollo de los primeros. En general se obtienen buenos resultados empleando:
- medios a base de infusión de vegetales, con el agregado de azúcares, por ej. agar-papa- glucosa-ácido tartárico. El ácido tartárico se emplea para llevar el pH a 3,5 pues así se inhibe el crecimiento de casi todas las bacterias.
- agar papa-dextrosa con agregado de 40 µg/g de cloranfenicol.
ANALISIS DE AFLATOXINAS EN ALIMENTOS
Existen dos tipos básicos de métodos para el análisis de aflatoxinas en alimentos:
a) métodos biológicos: realizados sobre animales de prueba sensibles al efecto tóxico (en
este caso generalmente se utilizan patos de un día pero también pueden emplearse embriones de pollo, larvas de peces, etc.).
Son de utilidad para los estudios confirmatorios, particularmente cuando surgen dificultades analíticas en el caso de ciertos alimentos. Pero estos métodos insumen demasiado tiempo para el análisis de rutina como el que se precisa en un programa de control de calidad y para este fin se requieren métodos químicos.
b) métodos químicos: el procedimiento para la determinación de aflatoxinas en un dado
producto consta en rasgos generales de las siguientes etapas: 1) muestreo y preparación de muestra para el análisis.
2) desgrasado (es necesario cuando el material contiene más del 5% de aceite). 3) extracción de la toxina utilizando un solvente adecuado.
4) purificación del extracto para eliminar material fluorescente interferente.
5) determinación de la concentración, generalmente por cromatografía en placa delgada, en la cual se observa la fluorescencia característica de estas sustancias con luz ultravioleta.
Según el producto que se deba analizar, algunas de estas etapas pueden omitirse.
En algunos productos, especialmente en el caso de granos y semillas, la etapa de muestreo presenta dificultades. Esto se debe a la falta de homogeneidad de los lotes respecto a la contaminación con aflatoxinas, ya que estas se encuentran, por lo general, en una proporción muy pequeña en los granos y es difícil obtener una muestra representativa en condiciones prácticas.
La selección del método a utilizar depende fundamentalmente del producto y del número de muestras a analizar. Por ejemplo, en algunos casos la etapa de desgrasado puede omitirse y la eliminación del aceite se realiza junto con la extracción, como veremos para el caso del maní. En los casos en que hay interferencia fluorescente es necesario incluir una etapa de purificación en columna cromatográfica.
AFLATOXINAS. REGLAMENTO TÉCNICO SOBRE LÍMITES MÁXIMOS DE MERCOSUR. GMC RES No 056/94 (RES MS y AS No 110 del 4.04.95)
ALIMENTO AFLATOXINA LIMITE
Leche
Leche fluida M1 0,5 µg/l
Leche en polvo M1 5,0 µg/kg
Maíz
Maíz en grano (entero, partido, aplastado, mondado) B1+ B2+ G1+ G2 20 µg/kg
Harinas o sémolas de maíz B1+ B2+ G1+ G2 20 µg/kg
Maní
Maní (sin descascarar, descascarado, crudo o tostado) B1+ B2+ G1+ G2 20 µg/kg
METODO PARA ANALIZAR AFLATOXINAS EN MUESTRAS DE MANI (AOAC 970.45 1995)
1) Extracción
1 - Tomar 100 g de muestra molida y colocar en una licuadora junto con 4 g de NaCl, 500 ml de metanol-agua (55+45) y 200 ml de hexano.
2 - Licuar 1 minuto a alta velocidad. 3 - Filtrar por papel de filtro.
4 - Tomar 25 ml de la solución metanol-agua (capa inferior) y colocarla en una ampolla de decantación con 25 ml de cloroformo.
5 - Tapar la ampolla de decantación y agitar 1 minuto.
6 - Recoger la capa clorofórmica (inferior) y llevar a sequedad en baño maría bajo corriente de nitrógeno o en un evaporador rotatorio.
7- Determinar la presencia de aflatoxinas por cromatografía en capa delgada.
2) Determinación de aflatoxinas por cromatografía en capa fina
Utilizar placas de sílica gel G o GF 254 según Sthal, de 250 micrones de espesor, activadas a 80°C durante dos horas. Los sistemas de solventes que se utilizan son: acetona-cloroformo (1+9) y benceno-acetona-ácido acético (80+9+10) a temperatura ambiente.
Se utilizan cubas sin saturar y sin papel.
1 - Tomar el extracto seco con 250 microlitros de cloroformo.
2 - Sembrar en la placa 10 microlitros de la muestra a analizar, 10 microlitros de la muestra con 10 microlitros de estándar interno y 10 microlitros de estándar.
3 - Correr la muestra durante 45 min (hasta que el solvente esté a 5 mm del borde superior de la placa).
4 - Secar la placa boca arriba y en posición horizontal preferentemente en la oscuridad. 5 - Observar a la luz ultravioleta.
La ausencia de fluorescencia en los 10 microlitros de muestra sembrada indica menos de 25 microgramos/kg de aflatoxina.
3) Cuantificación por el método de comparación visual
1- Sembrar 2, 5 y 10 microlitros de aflatoxina B1 (estándar) y desarrollar el cromatograma.
2- Comparar la intensidad de fluorescencia de las manchas del extracto con la intensidad de fluorescencia de las manchas del estándar.
3- Aplicar la siguiente ecuación:
Vs . Cs . Md Concentración de aflatoxina (microgramos/kg) = --- Vx . P
Vs: volumen de estándar (microlitros) cuya intensidad de fluorescencia es igual a la que presenta un determinado volumen de muestra.
Md: volumen (microlitros) de la dilución final del extracto de muestra (para este caso 250 microlitros).
Vx: volumen de muestra (microlitros) cuya intensidad de fluorescencia es igual a la de Vs. P: masa (g) de la muestra original en el extracto final (en este caso 5 g).
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LECHE FLUIDA 1) Toma de muestra
Cuando el muestreo de leche fluida se realiza a partir de los tanques o tarros de las granjas utilizados para el transporte a granel, los tanques de almacenamiento de las centrales lecheras o los tanques móviles de almacenamiento hay que asegurarse de que se haya mezclado el contenido hasta hacerlo homogéneo. Se vierte entonces una cantidad adecuada de leche en condiciones asépticas en los recipientes de muestreo, utilizando para ello un cucharón o tubo de muestreo esterilizado para cada muestra (ICMSF recomienda tomar por lo menos 30 ml de muestra). Estas muestras se enfrían inmediatamente manteniéndolas a una temperatura de 0-4ºC, y se envían al laboratorio.
Cuando se trata de un producto final envasado (como la leche pasteurizada), es preferible llevar la muestra al laboratorio sin abrir. Se enfrían y se llevan al laboratorio lo más rápidamente posible para que puedan comenzar los ensayos antes de que transcurran 36 h. Previamente al análisis se mezcla la muestra cuidadosamente agitando o invirtiendo el recipiente con el fin de lograr una distribución uniforme de los microorganismos en la muestra.
2) Preparación de la muestra
Colocar 1 ml de leche en un tubo de dilución que contiene 9 ml de agua peptona al 0,1%. Mezclar bien y realizar las diluciones siguientes tomando siempre 1 ml y transfiriendo este volumen a 9 ml del medio de dilución. Se hacen tantas diluciones como sean necesarias.
3) Metodología de análisis
a) Recuento microscópico directo (recuento de bacterias totales en leche) b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas
c) Recuento de bacterias psicrotróficas d) Recuento de coliformes totales e) Determinación de coliformes totales f) Recuento de coliformes a 45°C g) Determinación de Escherichia coli
a) Recuento microscópico directo (recuento de bacterias totales en leche) Método de Breed-Newman (APHA, 1976)
El método consiste en contar los microorganismos vivos y muertos de la muestra. La validez de este método se limita a las muestras con recuentos elevados, mientras que aporta escasa información respecto a las muestras que contienen un número reducido de microorganismos Preparación de la película
1- Mezclar bien la muestra por agitación.
2- Transferir 0,01 ml al recuadro de un portaobjeto especial limpio. El recuadro marcado tiene 1 cm de lado.
3- Distribuir el material sobre el recuadro mediante un ansa cuyo extremo forme un pequeño ángulo recto.
4- Secar el extendido al aire o bien colocándolo sobre una chapa caliente, cuidando que no sobrepase los 45ºC.
5- Los extendidos de los alimentos ricos en grasa deben ser desengrasados sumergiéndolos en xileno durante 5 minutos.
7- Sin secarlo se lo tiñe con la solución colorante sumergiéndolo durante 30 segundos. El exceso de colorante es eliminado colocando el borde del portaobjeto sobre un papel absorbente.
8- Secar cuidadosamente al aire y, una vez seco, sumergir en una cubeta con agua lo necesario como para que ésta no tome color. Secar al aire.
Solución colorante
Solución madre al 2% de Azul de Metileno en alcohol absoluto 96º. Se toman 30 ml de la solución madre y se diluyen con agua destilada hasta 1 litro.
Examen microscópico
La película se examina primero con un objetivo seco de gran apertura y después con el objetivo de inmersión.
Se calculan los microorganismos presentes en 1 ml de la porción de muestra de la siguiente manera: cuando las células de un mismo tipo morfológico se presentan en racimos, éstos se cuentan como unidades individuales, sólo si la distancia entre las células es igual o mayor al doble del diámetro menor de las dos células que estén más próximas entre sí; las células de morfología diferente o con tinción diferente se cuentan como unidades también diferentes independientemente de su proximidad a las demás células.
Para examinar una parte representativa de la película, se escoge un campo de partida situado a la misma distancia de cualquiera de los dos lados (punto medio del preparado sobre uno de los lados) y dos o tres campos adentro a partir del borde (superior o inferior). Se cuentan los campos de una serie a través de la película en forma horizontal, y después se empieza a contar desde el centro que habíamos tomado como punto de partida una serie de campos separados en un sentido perpendicular a la primera serie.
Si fuese necesario examinar un número mayor de campos, se repite la selección de campos según la explicación anterior, partiendo de un punto situado a 2 mm de distancia de la primera serie elegida. Se contarán entre 30 y 60 campos. Si el número de microorganismos es menor de 30000 bacterias/ml ó g, se efectuará el recuento de 60 campos. Si es de 30000 bacterias/ml ó g a 300000 bacterias/ml ó g basta el recuento de 20 a 30 campos. Si es mayor a 300000 bacterias/ml ó g se recuentan tantos campos como fuesen necesarios para obtener 150 a 200 gérmenes en la suma de todos ellos.
Cálculo
Se calcula el valor promedio de gérmenes por campo y se multiplica este valor por el factor microscópico (FM) y por (la inversa de la alícuota tomada) el número recíproco de la dilución:
RECUENTO Promedio de Recíproca de la MICROSCÓPICO = microorganismos por campo * FM * dilución
DIRECTO/ml ó g Donde FM = 100/A. A es el área del campo microscópico (la mayoría de los microscopios para alumnos tienen un diámetro de campo de 0,16 mm). FM = 4970/cm
b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas (FIL 100B: 1991)
1- Se vierte 1 ml de cada dilución por duplicado en placas de Petri y se agrega el agar para recuento (APC) con 0,1 % de leche en polvo descremada ya fundido y mantenido a aprox.
44-46ºC. Se mezcla para lograr una distribución homogénea. Siguiendo las mismas indicaciones, sembrar tres diluciones sucesivas.
2- Cuando las placas estén frías se invierten y se incuban a 30ºC ± 1°C durante 72h ± 3h. 3- Se cuentan las colonias y se calcula el valor de recuento total siguiendo las pautas dadas en el capítulo de muestreo. Se seleccionan las placas con recuento entre 25 y 250 colonias, se multiplica el número promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilución correspondiente y se informa como “UFC de bacterias aerobias mesófilas/ml ó g”.
c) Recuento de bacterias psicrotróficas (APHA, 1992)
Este recuento puede realizase bajo diferentes combinaciones de temperatura/tiempo.
1- Se procede de la misma forma que para el recuento de aerobios (b) pero incubando a 7ºC por 10 días (ó, 21°C por 25 horas ó, 18°C por 45 horas). Se informa “UFC de bacterias psicrótrofas /ml ó g”
d) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A: 1985)
El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio sólido o en medio líquido (por la técnica de NMP: número más probable).
d.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa)
Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri. Agregar aprox. 12 ml de agar ABRV fundido a aprox. 44-46ºC. Mezclar. Dejar solidificar completamente y agregar entonces 4 ml más de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las placas invertidas a 30ºC por 22-26 h.
Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas oscuras con diámetro de por lo menos 0,5 mm, características de bacterias coliformes.
Confirmación: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto). Incubar a 30ºC por 22-26 h. Se consideran positivas aquellas colonias que den producción de gas.
El resultado se calcula en base al número de colonias confirmadas. Se expresa como “UFC de coliformes totales /ml ó g”.
La confirmación de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que contengan otros azúcares distintos de lactosa.
d.2) Técnica del número más probable (NMP) Prueba presuntiva
Inocular por triplicado 1ml de muestra y de las diluciones sucesivas en tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30ºC por 48 h. Se consideran positivos aquellos tubos que presenten formación de gas en la campanita de Durham.
De ser necesario, inocular 10 ml de muestra en vez de 1 ml. En este caso se utilizarán tubos doble concentración de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares.
Prueba de confirmación
Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno). Incubar a 30ºC por 22-26 h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metálico.
Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/ml ó g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.
e) Determinación de coliformes totales (Basado en Mossel, 1985)
Inocular 1 ml de muestra en 10 ml de caldo triptona peptona de soja (CTS).
Incubar a 20-25ºC por 5-6 h. Agitar bien y volcar en un tubo que contenga 10 ml de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares doble concentrado (con campanita de Durham). Incubar a 30ºC ±1°C durante 18-24 h.
Los tubos en los que no se verifique formación de gas se consideran negativos. En este caso se informa “ausencia de coliformes totales en 1 ml¨.
Agitar bien el contenido de los tubos positivos, resembrar por estría en agar EMB. Incubar a 37±1°C por 24 horas. Las colonias típicas de coliformes son oscuras, rojas-rosadas o mucosas. Si se verifica crecimiento de estas características, se informa ¨presencia de coliformes en 1 ml¨.
f) Recuento de coliformes a 45°C (APHA, 1992)
A partir de los tubos positivos en d.2 (coliformes totales a 30°C, por NMP), inocular un tubo de fermentación de caldo EC. Incubar 24 h a 45°C. La producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes a 45°C (coliformes fecales).
Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45°C/ml ó g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.
g) Determinación de Escherichia coli (Mossel y Moreno García, "Microbiología de los
alimentos. Fundamentos ecológicos para garantizar y comprobar la inocuidad y calidad de los alimentos."; Ed. Acribia, 1985).
Inocular 1 ml de muestra en 10 ml de caldo triptona peptona de soja (CTS).
Incubar a 20-25ºC por 5-6 h. Agitar bien y volcar en un tubo que contenga 10 ml de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares doble concentrado (con campanita de Durham). Incubar a 30ºC ± 1°C durante 18-24 h.
Los tubos en los que no se verifique formación de gas se consideran negativos. En este caso se informa “ausencia de E. coli “
Agitar bien el contenido de los tubos positivos, resembrar por estría en agar Mac Conkey. Incubar a 44ºC±0,1°C (preferentemente en baño de agua) durante 30 h. Si existiese crecimiento típico (colonias rojas), tomar colonias aisladas y realizarles:
1- Gram
2- Siembra en tubo de fermentación caldo verde brillante 2% sales biliares con lactosa. Incubar a 44°C por 48 horas.
3- Siembra en caldo triptona. Incubar a 44°C por 48 horas 4- Siembra en agar citrato. Incubar a 30°C por 48 horas. Resultados característicos:
1- Cocobacilo Gram negativo no formador de esporas. 2- Fermentación de lactosa a 44°C con formación de gas.
3- Producción de indol a 44°C 4- No utiliza citrato
Alternativamente se pueden utilizar las pruebas del IMViC para la identificación.
De ser posible ensayar el cultivo sospechoso con un sistema de pruebas múltiples (API, MICRO-ID, o semejantes).
En caso de confirmarse, informar “presencia de E. coli” en 1 ml de muestra. Indicar las pruebas de identificación realizadas.
4) Antibióticos en leche
Durante el tratamiento de la mastitis, se usan antibióticos que pueden aparecer eventualmente en la leche de los animales bajo tratamiento. Los antibióticos residuales, pueden producir interferencias en el proceso de fermentación láctica, que se lleva a cabo para la fabricación de quesos y otros productos lácteos.
Investigación de antibióticos
Un ensayo práctico consiste en calentar 100 ml de leche en un erlenmeyer por 2-5 minutos a 83ºC (para evitar falsos positivos debido a sustancias inhibidoras naturales en la leche cruda que la pasteurización reduce pero no elimina completamente). Enfriar a 45ºC y agregar una cucharadita de yogurt (Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus). Incubar a 45ºC y examinar a las 2-3 h. Si la leche no ha coagulado es probable la presencia de antibióticos.
ANÁLISIS DE LECHE EN POLVO
1) Toma de muestra
Para el muestreo, es preferible tomar como muestra los recipientes o paquetes originales, sin abrir. Cuando haya que muestrear productos a granel, la muestra se tomará en un punto cerca del centro del recipiente que la contiene, si es posible, quitando la capa superficial de polvo con un instrumento esterilizado, y extrayendo después la muestra con una cuchara o varilla esterilizada. ICMSF recomienda para cada producto a granel tomar no menos de 30 g.
2) Preparación de la muestra
Con una cuchara estéril mezclar el contenido del frasco de leche en polvo. Pesar asépticamente 10 g de muestra en un erlenmeyer que contenga 90 ml de agua peptona 0,1% previamente calentada a no más de 45ºC. Agitar hasta disolución de grumos.
Preparar las siguientes diluciones transfiriendo 1 ml a un tubo con 9 ml de agua peptona al 0,1%.
La mayoría de las leches en polvo pueden ser disueltas en agua peptona al 0,1% o en solución salina de fosfatos tamponada. Las muestras más insolubles (por ejemplo leches de alta acidez) se disuelven bien agregando 1,25 % de citrato de sodio a la solución de fosfatos.
3) Metodología de análisis
a) Recuento microscópico directo (recuento de bacterias totales en leche) b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas
c) Recuento de coliformes totales d) Recuento de coliformes a 45°C e) Recuento de Staphylococcus aureus f) Determinación de Salmonella
a) Recuento microscópico directo (recuento de bacterias totales en leche) Método de Breed-Newman (APHA, 1976)
El método consiste en contar los microorganismos vivos y muertos de la muestra. La validez de este método se limita a las muestras con recuentos elevados, mientras que aporta escasa información respecto a las muestras que contienen un número reducido de microorganismos. Preparación de la película
1- Mezclar bien la muestra por agitación.
2- Transferir 0,01 ml al recuadro de un portaobjeto especial limpio. El recuadro marcado tiene 1 cm de lado.
3- Distribuir el material sobre el recuadro mediante un ansa cuyo extremo forme un pequeño ángulo recto.
4- Secar el extendido al aire o bien colocándolo sobre una chapa caliente, cuidando que no sobrepase los 45ºC.
5- Los extendidos de los alimentos ricos en grasa deben ser desengrasados sumergiéndolos en xileno durante 5 minutos.
6- Luego de secar al aire se lo fija sumergiéndolo en alcohol absoluto durante 2-3 minutos. 7- Sin secarlo se lo tiñe con la solución colorante sumergiéndolo durante 30 segundos. El exceso de colorante es eliminado colocando el borde del portaobjeto sobre un papel absorbente.
8- Secar cuidadosamente al aire y, una vez seco, sumergir en una cubeta con agua común lo necesario como para que ésta no tome color. Secar al aire.
Solución colorante
Solución madre al 2% de Azul de Metileno en alcohol absoluto 96º. Se toman 30 ml de la solución madre y se diluyen con agua destilada hasta 1 litro.
Examen microscópico
La película se examina primero con un objetivo seco de gran apertura y después con el objetivo de inmersión.
Se calculan los microorganismos presentes en 1 ml de la porción de muestra de la siguiente manera: cuando las células de un mismo tipo morfológico se presentan en racimos, éstos se cuentan como unidades individuales, sólo si la distancia entre las células es igual o mayor al doble del diámetro menor de las dos células que estén más próximas entre sí; las células de morfología diferente o con tinción diferente se cuentan como unidades también diferentes independientemente de su proximidad a las demás células.
Para examinar una parte representativa de la película, se escoge un campo de partida situado a la misma distancia de cualquiera de los dos lados (punto medio del preparado sobre uno de los lados) y dos o tres campos adentro a partir del borde (superior o inferior). Se cuentan los campos de una serie a través de la película en forma horizontal., y después se empieza a contar desde el centro que habíamos tomado como punto de partida una serie de campos separados en un sentido perpendicular a la primera serie.
Si fuese necesario examinar un número mayor de campos, se repite la selección de campos según la explicación anterior, partiendo de un punto situado a 2 mm de distancia de la primera serie elegida. Se contarán entre 30 y 60 campos. Si el número de microorganismos es menor de 30000 bacterias/ml ó g, se efectuará el recuento de 60 campos. Si es de 30000 a 300000 gérmenes /ml ó g basta el recuento de 20 a 30 campos. Si es mayor a 300000 gérmenes /ml ó g se recuentan tantos campos como fuesen necesarios para obtener 150 a 200 gérmenes en la suma de todos ellos.
Cálculo
Se calcula el valor promedio de gérmenes por campo y se multiplica este valor por el factor microscópico (FM) y por (la inversa de la alícuota tomada) el número recíproco de la dilución RECUENTO Promedio de Recíproca de la
MICROSCÓPICO = microorganismos por campo * FM * dilución
DIRECTO/ml ó g Donde FM = 100/A. A es el área del campo microscópico (la mayoría de los microscopios para alumnos tienen un diámetro de campo de 0,16 mm). FM = 4970/cm
b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas (FIL 100B: 1991)
1- Se vierte 1 ml de cada dilución por duplicado en placas de Petri y se agrega el agar para recuento (APC) con 0,1 % de leche en polvo descremada ya fundido y mantenido a aprox. 44-46ºC. Se mezcla para lograr una distribución homogénea.
Siguiendo las mismas indicaciones, sembrar tres diluciones sucesivas.
2- Cuando las placas estén frías se invierten y se incuban a 30ºC ± 1°C durante 72h ± 3 h. 3- Se cuentan las colonias y se calcula el valor de recuento total siguiendo las pautas dadas en el capítulo de muestreo. Se seleccionan las placas con recuento entre 25 y 250 colonias, se
multiplica el número promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilución correspondiente y se informa como “UFC de bacterias aerobias mesófilas/g”.
c) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A:1985)
El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio sólido o en medio líquido (por la técnica de NMP: número más probable).
c.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa) Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri.
Agregar aprox. 12 ml de agar ABRV fundido a aprox. 44-46ºC. Mezclar. Dejar solidificar completamente y agregar entonces 4 ml más de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las placas invertidas a 30ºC por 22-26 h.
Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas oscuras con diámetro de por lo menos 0,5 mm, características de bacterias coliformes.
Confirmación: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto). Incubar a 30ºC por 22-26 h. Se consideran positivas aquellas colonias que den producción de gas.
El resultado se calcula en base al número de colonias confirmadas. Se expresa como “UFC de coliformes totales/g”.
La confirmación de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que contengan otros azúcares distintos de lactosa.
c.2) Técnica del número más probable (NMP) Prueba presuntiva
Inocular por triplicado 1ml de muestra y de las diluciones sucesivas en tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30ºC por 48 h. Se consideran positivos aquellos tubos que presenten formación de gas en la campanita de Durham.
De ser necesario, inocular 10 ml de muestra en vez de 1 ml. Se utilizarán tubos doble concentrado de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares.
Prueba de confirmación
Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno). Incubar a 30ºC por 22-26 h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro/ rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metálico.
Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.
d) Recuento de coliformes a 45°C (APHA, 1992)
A partir de los tubos positivos c.2 (coliformes totales a 30°C, por NMP), inocular un tubo de fermentación de caldo EC. Incubar 24 h a 45°C. La producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes a 45°C (coliformes fecales).
Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45°C/g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.
e) Recuento de Staphylococcus aureus (FIL 145:1990)
Se recomienda realizar el recuento sembrando por duplicado cada dilución.
En caso de requerir un inóculo más grande por un valor bajo del requisito microbiológico de aceptación, puede hacerse una siembra combinada de la siguiente forma:
Distribuir 1 ml de dilución 1/10 equitativamente en la superficie de tres placas de agar Baird Parker perfectamente secas. Distribuir con una espátula de Drigalsky cuidadosamente (tener la precaución de enfriar bien la espátula para no matar los microorganismos). Dejar secar las placas tapadas sin invertir a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Una vez secas, incubarlas invertidas a 37± 1ºC durante 24-48 h.
Tomar para enumerar placas con no más de 150 colonias. Seleccionar un número representativo de colonias típicas y atípicas; y transferirlas a tubos de caldo infusión cerebro-corazón. Incubar a 37°C ó 35ºC por 20 a 24 h.
Las colonias típicas son negras, brillantes y convexas rodeadas de una zona clara, generalmente un halo opaco rodea a la colonia por dentro de la zona clara.
Identificación y confirmación
Sobre los cultivos puros de 20-24 horas, realizar: - Tinción de Gram
- Catalasa
- Coagulasa (comparar con cepa patrón): Agregar 0,1 ml del cultivo a aprox. 0,3 ml de plasma de conejo reconstituido en un tubo estéril. Incubar a 35-37°C. Examinar después de 4 a 6 horas. El coágulo formado debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo (4+).
Realizar un control empleando 0,1 ml de caldo BHI estéril en lugar del cultivo. Para que el ensayo sea válido, no debe observarse ningún signo de coagulación.
Complementariamente puede realizarse la prueba de la termonucleasa sobre la misma placa de Baird Parker.
S. aureus coagulasa positiva son cocos Gram positivos, catalasa positivo, coagulasa positivo
(3 o 4+) y termonucleasa positivo.
Informar “UFC de S. aureus coagulasa positivo/ g de muestra”. Para realizar el cálculo contar el número total de colonias confirmadas en las tres placas.
f) Determinación de Salmonella (FIL 93 A: 1985)
Preenriquecimiento en medio líquido
Preparar un erlenmeyer con 225 ml de agua destilada con 1 ml de solución de Verde Brillante (0,5% en agua, agregar verde brillante al agua; dejar la solución en la oscuridad por lo menos un día para autoesterilizar).
Pesar asépticamente 25g de muestra en dicho erlenmeyer. Dejar a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h sin agitar. Incubar a 37ºC durante 16-20 h.
Si al cabo de 3 h de incubación todavía no se ha disuelto la leche en polvo, agitar el frasco para mezclar su contenido.
Enriquecimiento en medio líquido.
Transferir 10 ml de preenriquecimiento a 100 ml de caldo tetrationato (Müller Kauffmann). Incubar a 43 ± 0,5ºC durante 18-24 h.
Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a 37± 1ºC durante 18-24 h.
Aislamiento en medio sólido
A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Verde Brillante-Rojo Fenol (agar BPLS) y una de agar Bismuto Sulfito (son cuatro placas en total). Incubar las placas invertidas a 37 ± 1ºC durante 20-24 h.
De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento 18-24 h más y volver a estriar en los medios de aislamiento.
Si al cabo del período de incubación el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por 18-24 h adicionales a la misma temperatura.
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella. En agar BPLS, las colonias son rosadas y el medio circundante rojo brillante. En agar Bismuto Sulfito, las colonias típicas son marrones a negras con brillo metálico. Algunas cepas forman colonias verdosas.
Identificación y confirmación
De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 37± 1ºC durante 18-24 h. Al cabo de la incubación, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmación bioquímica y serológica.
Sobre el cultivo puro realizar - tinción de Gram
- oxidasa
Inocular los cultivos que resulten coco-bacilos Gram negativos y oxidasa negativos en los siguientes medios.
- TSI: en superficie y en profundidad
- Medio LIA
- Medio para ureasa (puede ser BAM)
- β-galactosidasa
- Reacción de Voges Proskauer - Reacción de indol
Consultar TP N°2 - Salmonella, para desarrollar los ensayos y consultar los resultados característicos.
De ser posible confirmar el resultado con un sistema de pruebas múltiples. Confirmación serológica
Seguir la técnica explicada en TP Nº 2: Enterobacterias – Salmonella.
Emplear una cepa patrón de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios empleados en las pruebas de confirmación e identificación.
Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el análisis (25 g, en este caso).
REQUISITOS MICROBIOLOGICOS DEL CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO - MERCOSUR
• LECHE
Art. 558 (Res. MSyAS N°047 del 28.01.98):
...La leche entera pasteurizada, deberá responder a las siguientes exigencias:
a) Estar exenta de gérmenes patógenos. Esta exigencia no se dará por cumplida si presenta:
1- Recuento total en placa: mayor de 50.000 bacterias mesófilas/cm3 en los meses de abril a
septiembre inclusive y mayor de 100.000 bacterias /cm3 en los meses de octubre a marzo,
inclusive.
2- Bacterias coliformes (recuento en placa con medio agar-violeta-rojo-bilis): mayor de
50/cm3
3- Escherichia coli: presencia en 1cm3. Deberá ser confirmada por pruebas bioquímicas.
4- Prueba de la fosfatasa positiva.
Art. 559 (Res. MSyAS N°047 del 28.01.98):
Leche entera seleccionada pasteurizada.
Sin haber sido sometida a ningún tratamiento previo, debe presentar un contenido microbiano
no mayor de 500.000 bacterias mesófilas/cm3.
La leche entera seleccionada pasteurizada deberá estar exenta de gérmenes patógenos. Esta exigencia no se dará por cumplida si presenta:
1- Recuento total en placa: mayor de 25.000 bacterias mesófilas/cm3 de abril a septiembre,
inclusive y mayor de 35.000 bacterias mesófilas/cm3 de octubre a marzo, inclusive.
2- Bacterias coliformes (recuento en placa con medio agar-violeta-rojo-bilis): mayor de
10/cm3
3- Escherichia coli: presencia en 1cm3. Deberá ser confirmada por pruebas bioquímicas.
4- Prueba de la fosfatasa positiva.
Art. 559bis (Res. MSyAS N°047 del 28.01.98):
Leche entera certificada pasteurizada.
Sin haber sido sometida a ningún tratamiento previo, no debe presentar gérmenes patógenos y
su contenido microbiano no debe ser superior a 10.000 bacterias mesófilas/cm3.
La leche entera certificada pasteurizada deberá estar exenta de gérmenes patógenos. Esta exigencia no se dará por cumplida si presenta:
1- Recuento total en placa: mayor de 5.000 bacterias mesófilas/cm3 en el momento de su
recepción por el consumidor.
2- Bacterias coliformes presencia en 1/cm3
3- Prueba de la fosfatasa positiva.
Art. 559tris (Res. MSyAS N°328 del 21.05.97):
“Se entiende por leche ultrapasteurizada a la leche, homogeneizada o no, que haya sido sometida durante por lo menos 2 segundos a una temperatura mínima de 138°C mediante un proceso térmico de flujo continuo, inmediatamente enfriada a menos de 5°C y envasada en forma no aséptica en envases estériles y herméticamente cerrados”.
Deberá responder a las siguientes exigencias:
CATEGORIA ICMSF VALORES
1- Recuento de mesófilos totales /cm3: 3 n=5 c=2 m=102 M=103
2- Recuento de coliformes a 30°C/cm3: 6 n=5 c=2 m<3 M=10
3- Recuento de coliformes a 45°C/cm3: 6 n=5 c=1 m<3 M=10
4- Prueba de la fosfatasa Negativa
5- Prueba de la peroxidasa Negativa
Leche UHT
Res MS y AS Nº 110 del 4.04.95 GMC Res. N° 78/94
MICROORGANISMOS CRITERIO DE ACEPTACION CATEGORIA
I.C.M.S.F. METODO DE ENSAYO Microorganismos aerobios mesófilos viables/ml n=5 c=0 m= 100 2 FIL1008: 1991
Resoluciones MS y AS: N°003 del 11.01.95 y N° 433 del 25.06.97
Leche en polvo
Criterios microbiológicos y tolerancias
MICROORGANISMOS CRITERIO DE ACEPTACION (Codex, Vol. H CAC/RCP 31-83)
CATEGORIA I.C.M.S.F. METODO DE ENSAYO Microorganismos aerobios mesófilos viables/g n=5 c=2 m= 30000 M=100000 2 FIL100:A 1987
Coliformes (a 30°C)/g n=5 c=2 m= 10 M=100 5 FIL 73A: 1985
Coliformes (a 45°C)/g n=5 c=2 m< 3 M=10 5 APHA 1992
Cáp. 24
S. aureus coag. pos./g n=5 c=1 m= 10 M=100 8 FIL 60A: 1978
ANÁLISIS DE MANTECAS Y MARGARINAS 1) Preparación de la muestra y diluciones: (FIL 73 A:1985)
Colocar en un tubo estéril con capacidad para 50 ml, la muestra de manteca o margarina, de
forma de no superar el 50% de la capacidad del tubo.
Fundir la muestra en baño de agua a 45ºC durante 15 minutos agitando para evitar la separación del suero de la grasa.
Transferir con una pipeta precalentada 10 ml de material del material fundido a un erlenmeyer con 90 ml de agua de dilución estéril a 45ºC (dilución 1/10). Homogeneizar por agitación evitando la separación de las fases. Las diluciones sucesivas se efectúan transfiriendo 1 ml a tubos conteniendo 9 ml de agua de dilución estéril a 45ºC.
Alternativamente se puede trabajar solamente con la fase acuosa y sus diluciones. Permitir la separación de las fases (dejar reposar a 45°C por no más de 15 minutos) y tomar de la fase inferior: 1 ml equivale a 1 gramo de manteca.
2) Metodología de análisis
a) Recuento de bacterias psicrotróficas b) Recuento de bacterias proteolíticas c) Recuento de bacterias lipolíticas d) Recuento de coliformes totales e) Recuento de coliformes a 45°C f) Determinación de Escherichia coli g) Recuento de hongos y levaduras h) Recuento de Staphylococcus aureus i) Determinación de Salmonella
a) Recuento de bacterias psicrotróficas (APHA, 1992)
Este recuento puede realizase bajo diferentes combinaciones de temperatura/tiempo.
Se procede de la misma forma que para el recuento de aerobios empleando agar para recuento en placa (APC) con 0,1 % de leche en polvo descremada ya fundido y mantenido a aprox. 44-46ºC. Se mezcla para lograr una distribución homogénea. Siguiendo las mismas indicaciones, sembrar tres diluciones sucesivas. Se incuba a 7ºC por 10 días (ó, 21°C por 25 horas ó, 18°C por 45 horas). Se informa “UFC de bacterias psicrótrofas /ml ó g”.
b) Recuento de bacterias proteolíticas (APHA, 1992)
Medio de cultivo: agar para recuento en placa (APC) con leche al 10%.
Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas en placas de Petri. Agregar el agar fundido a 44-46ºC y mezclar para homogeneizar el inóculo en el agar.
Si el recuento esperado es bajo, puede realizarse un recuento combinado distribuyendo 10 ml de la dilución 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar de la misma forma que antes.
Dejar solidificar. Incubar invertidas a 21± 2ºC durante 72 horas.
Para revelar, si no se observaran directamente los halos de clarificación, inundar las placas con HCl 1% o ácido acético 10% durante 1 minuto, volcando luego el ácido.
Si el recuento se realizó en duplicado, emplear las placas que contengan entre 25 y 250 colonias. Tener en cuenta la dilución empleada.
Si se hizo el recuento combinado, contar el número de colonias en las tres placas. Corresponden al número de bacterias proteolíticas en 1 g de muestra.
Informar como “UFC de bacterias proteolíticas /g”.
c) Recuento de bacterias lipolíticas (APHA, 1992)
Medio de cultivo: agar tributirina
Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas en placas de Petri. Agregar el agar fundido a 44-46ºC y mezclar para homogeneizar el inóculo en el agar.
Si el recuento esperado es bajo, puede realizarse un recuento combinado distribuyendo 10 ml de la dilución 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar de la misma forma que antes.
Dejar solidificar. Incubar invertidas a temperaturas entre 20 a 30ºC durante 72 horas. La hidrólisis de la tributirina se evidencia como una zona clara alrededor de las colonias. Si el recuento se realizó en duplicado, emplear las placas que contengan entre 25 y 250 colonias. Tener en cuenta la dilución empleada.
Si se hizo el recuento combinado, contar el número de colonias en las tres placas. Corresponden al número de bacterias lipolíticas en 1 g de muestra.
Informar como “UFC de bacterias lipolíticas /g”
d) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A: 1985)
El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio sólido o en medio líquido (por la técnica de NMP: número más probable).
d.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa) Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri.
Agregar aprox. 12 ml de agar ABRV fundido a aprox. 44-46ºC. Mezclar. Dejar solidificar completamente y agregar entonces 4 ml más de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las placas invertidas a 30ºC por 22-26 h.
Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas oscuras con diámetro de por lo menos 0,5 mm, características de bacterias coliformes.
Confirmación: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto). Incubar a 30ºC por 22-26 h. Se consideran positivas aquellas colonias que den producción de gas.
El resultado se calcula en base al número de colonias confirmadas. Se expresa como “UFC de coliformes totales /ml ó g”.
La confirmación de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que contengan otros azúcares distintos de lactosa.
d.2) Técnica del número más probable (NMP) Prueba presuntiva
Inocular por triplicado 1ml de muestra y de las diluciones sucesivas en tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30ºC por 48 h. Se consideran positivos aquellos tubos que presenten formación de gas en la campanita de Durham.
De ser necesario, inocular 10 ml de muestra en vez de 1 ml. Se utilizarán tubos doble concentración de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares.
Prueba de confirmación
Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno). Incubar a 30ºC por 22-26 h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro/ rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metálico.
Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/ml ó g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.
e) Recuento de coliformes a 45°C (APHA, 1992)
A partir de los tubos positivos en d.2 (coliformes totales a 30°C, por NMP), inocular un tubo de fermentación de caldo EC. Incubar 24 h a 45°C. La producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes a 45°C (coliformes fecales).
Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45°C/ml ó g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.
f) Determinación de Escherichia coli (Mossel y Moreno García, "Microbiología de los
alimentos. Fundamentos ecológicos para garantizar y comprobar la inocuidad y calidad de los alimentos."; Ed. Acribia, 1985)
Inocular 1 g de muestra en 10 ml de caldo triptona peptona de soja (CTS).
Incubar a 20-25ºC por 5-6 h. Agitar bien y volcar en un tubo que contenga 10 ml de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares doble concentrado (con campanita de Durham). Incubar a 30ºC ± 1°C durante 18-24 h.
Los tubos en los que no se verifique formación de gas se consideran negativos. En este caso se informa “ausencia de E. coli en 1 gramo”.
Agitar bien el contenido de los tubos positivos, resembrar por estría en agar Mac Conkey. Incubar a 44ºC± 0,1°C (preferentemente en baño de agua) durante 30 h. Si existiese crecimiento típico (colonias rojas), tomar colonias aisladas y realizarles
1- Gram
2- Siembra en tubo de fermentación caldo verde brillante 2% sales biliares con lactosa. Incubar a 44°C por 48 horas.
3- Siembra en caldo triptona. Incubar a 44°C por 48 horas 4- Siembra en agar citrato. Incubar a 30°C por 48 horas. Resultados característicos:
1- Cocobacilo Gram negativo no formador de esporas. 2- Fermentación de lactosa a 44°C con formación de gas. 3- Producción de indol a 44°C
4- No utiliza citrato
Alternativamente se pueden utilizar las pruebas del IMViC para la identificación
De ser posible ensayar el cultivo sospechoso con un sistema de pruebas múltiples (API, MICRO-ID, o semejantes).
En caso de confirmarse, informar “presencia de E. coli” en 1 ml de muestra. Indicar las pruebas de identificación realizadas.
