LA SUBUNIDAD PA DEL VIRUS
DE LA GRIPE
En nuestro laboratorio se han estudiado y caracterizado varios aspectos de la función de la subunidad PA de la polimerasa viral. Con objeto de estudiar las relaciones que el virus de la gripe establece con la célula infectada, realizamos una búsqueda de factores celulares que pudieran interaccionar con la subunidad PA y posiblemente ejercer algún efecto en sus actividades. La búsqueda se realizó mediante ensayos de doble-híbrido en levadura, donde rescatamos la interacción con dos clones que resultaron ser las proteínas humanas CHD6 (clon PA1) y hCLE/CGI- 99 (clon PAi13) (Huarte et al., 2001) (Fig. I9). Ambas proteínas también interaccionan con clones de PA que presentan una delección en el extremo amino terminal (dejando sólo los últimos 252 aminoácidos carboxilo terminal) o la mutación puntual T157A que disminuye su capacidad de proteólisis, lo que descarta la implicación de esta región en la unión a estos factores.
hCLE/CGI-99 ha sido relacionada con la transcripción celular ya que interacciona con la subunidad mayor de la RNAP II y se encuentra presente en sitios de transcripción activa mediada por la polimerasa celular (Pérez-González et al., 2006). Además, datos de expresión génica en células silenciadas para hCLE muestran una disminución en la expresión de un alto número de genes celulares lo que sugiere su actuación como modulador general de la transcripción mediada por la RNAP II. Estudios de la implicación de hCLE en la infección por el virus de la gripe indican su participación como modulador positivo de la replicación viral y su incorporación en viriones (Rodriguez, A., 2009).
CHD6 pertenece a una familia de remodeladores de cromatina de reciente caracterización. Aunque la función de CHD6 en la célula no ha sido estudiada en detalle, sí ha sido implicado en varias vías de transcripción celular y se le ha relacionado con la regulación de la expresión génica de un virus DNA (Tabla I1 e I2). Teniendo en cuenta la asociación de CHD6 con PA viral por ensayo de doble híbrido, un objetivo en nuestro laboratorio ha sido conocer la posible implicación de ésta proteína en la replicación del virus de la gripe. Otro objetivo abordado es el estudio de la interrelación entre CHD6, cromatina celular y el virus de la gripe, y de esta forma analizar posibles cambios celulares a nivel de cromatina inducidos durante la infección.
Figura I9. Datos de interacción en ensayo de doble híbrido utilizando la proteína PA viral como cebo. El clon pGBTPA que expresa la proteína PA completa fusionada con el dominio de
unión al promotor de GAL4 se cotransfecto con una librería de cDNAs de riñón humano fusionados al dominio de activación de GAL4 y construidos en el plásmido pGAD. Los únicos clones positivos capaces de pasar todos los filtros impuestos fueron GAD-PAi1 (CHD6) y GAD-PAi13 (hCLE). El mismo resultado se obtuvo cuando el ensayo se llevó a cabo usando como cebos las construccio- nes pGBTPAT157A (con mutación puntual en residuo 157 de PA crítico en la actividad proteolítica atribuida a PA) y pGBTPAΔ1-154 (con 154 aminoácidos deleccionados en el extremo N-terminal).
OBJETIVOS
Estudios previos en nuestro laboratorio habían identificado a la proteína celular CHD6 como un factor asociado a la polimerasa del virus de la gripe a través de la interacción con la subunidad PA. CHD6 pertenece a una familia de remodeladores de cromatina dependientes de ATP y contiene por lo menos un dominio que le podría permitir asociarse a cromatina. Además, una caracterización inicial de la función celular de CHD6, indica su asociación con sitios de síntesis de mensajero celular, lo cual sugiere su participación como factor de transcripción.
Teniendo en cuenta datos que destacan la fuerte relación que la polimerasa del virus de la gripe establece con la maquinaria de transcripción celular y la cromatina nuclear, nos pareció muy interesante profundizar en la posible implicación del factor asociado CHD6 en la infección por el virus de la gripe.
Con estos antecedentes, nos propusimos los siguientes objetivos concretos:
1.
- Analizar las interacciones que pudiera establecer CHD6 con las demás proteínas que forman parte de las RNPs virales.2.
- Estudiar la relevancia funcional de la proteína celular CHD6 en la infección por el virus de la gripe.3.
- Analizar el efecto que la infección por el virus de la gripe tiene sobre CHD6.4.
- Estudiar cambios que pudieran ocurrir en marcadores de cromatina activa e inactiva durante la infección por el virus de la gripe.OBJETIVOS
Estudios previos en nuestro laboratorio habían identificado a la proteína celular CHD6 como un factor asociado a la polimerasa del virus de la gripe a través de la interacción con la subunidad PA. CHD6 pertenece a una familia de remodeladores de cromatina dependientes de ATP y contiene por lo menos un dominio que le podría permitir asociarse a cromatina. Además, una caracterización inicial de la función celular de CHD6, indica su asociación con sitios de síntesis de mensajero celular, lo cual sugiere su participación como factor de transcripción.
Teniendo en cuenta datos que destacan la fuerte relación que la polimerasa del virus de la gripe establece con la maquinaria de transcripción celular y la cromatina nuclear, nos pareció muy interesante profundizar en la posible implicación del factor asociado CHD6 en la infección por el virus de la gripe.
Con estos antecedentes, nos propusimos los siguientes objetivos concretos: