CHD6 se asocia con las colas de la histona 3 metiladas y su patrón de unión cambia en

infección por el virus de la gripe

Ensayos de unión a péptidos sintéticos y análisis de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) han demostrado la asociación de CHD8 y CHD7, miembros pertenecientes a la subfamilia III de CHD, a marcas epigenéticas definidas por metilaciones en la lisina 4 de la histona 3 (Rodriguez-Paredes et al., 2009; Schnetz et al., 2009). Por otra parte, análisis filogenéticos basados en alineamientos de secuencias de todos los cromodominios en el genoma humano destacan la proximidad de secuencia entre los tándem de cromodominios de los miembros CHD de la subfamilia III (Flanagan et al., 2007; Yap & Zhou, 2011). Puesto que CHD6, remodelador de cromatina implicado en la transcripción celular (Lutz et al., 2006; Nioi et al., 2005), interacciona con las RNPs virales y, además, cambia su distribución intranuclear durante la infección por el virus de la gripe, analizamos si ésta proteína se asocia con residuos específicos metilados en histona 3 y si la asociación variaba durante la infección. Para abordar estos estudios se realizaron aproximaciones experimentales en condiciones in vitro e in vivo que se detallan a continuación.

Se realizó un primer abordaje in vitro a través de ensayos de pull-down de unión a péptidos sintéticos de histona 3. Los péptidos utilizados corresponden a las colas amino terminales de la histona 3 (1-21) o (22-44) que no contienen o contienen un único motivo de tri-metilación en la lisina 4, 9 o 27, y conjugados con biotina. Estos péptidos se unieron a resinas de avidina monomérica-agarosa y se usaron en ensayos de pull-down con extractos nucleares de células HEK293T pseudo-infectadas o infectadas con virus VIC (ver Fig. M2). Se usaron células infectadas a alta multiplicidad y recogidas a 6 h post-infección, ya que es un tiempo intermedio del ciclo viral donde el proceso de degradación de CHD6 acaba de empezar (Fig. R8) y, además, se observa un claro cambio en la distribución intranuclear de la proteína (Fig. R6). Después de lavados extensivos, se analizó por Western blot la presencia de las proteínas CHD6, CHD3 y HP1α, estos dos últimos usados como controles. No se observa una clara preferencia en la unión de CHD6 por los péptidos metilados cuando se utilizan extractos nucleares de células pseudo-infectadas (Fig. R16-A). No obstante, en extractos de células infectadas se aprecia una mayor asociación del remodelador de cromatina con marcadores de heterocromatina H3K9me3 y H3K27me3 (Fig. R16-B). Tanto los controles CHD3, como HP1α, no varían sus preferencias de unión cuando se utilizan

presencia de la proteína viral NP teniendo en cuenta las siguientes premisas: 1) NP es el componente mayoritario de los complejos ribonucleoproteinas (RNPs) virales que colocaliza con CHD6 durante la infección, y 2) estudios previos han demostrado la capacidad de interacción de NP con colas de histonas (Garcia-Robles et al., 2005). Notablemente, se observó una importante retención de NP junto a CHD6 en las resinas representando los marcadores de cromatina inactiva (Fig. R16-B).

Para confirmar estos resultados, realizamos estudios adicionales in vivo. Se llevaron a cabo análisis de colocalización por Inmunofluorescencia confocal en los que se examinaron cambios en la asociación de CHD6 con las marcas epigenéticas H3K4me3, -K9me3 y –K27me3, utilizados en apartados anteriores. Los análisis por Inmunofluorescencia confocal se llevaron a cabo utilizando secciones confocales individuales y máscaras de colocalización en los que se obtuvieron imágenes binarias mostrando solo pixeles solapantes (ver Materiales y Métodos). En células A549 no infectadas, CHD6 colocaliza principalmente con H3K4me3, aunque también se observó cierta asociación con H3K9me3 y H3K27me3 (Fig. R17, paneles MOCK, CHD6- H3Kme3). Este resultado confirma resultados previos que muestran la asociación de CHD6 con sitios de síntesis de mensajeros celulares en el núcleo celular (Lutz et al., 2006). El mismo análisis en células infectadas muestra no solo el cambio en la distribución intranuclear de CHD6 ya descrita, sino que también observamos un importante incremento en la colocalización CHD6-H3K9me3 (de 24% en pseudo-infección a 66% en infección) (Fig. R17, paneles 9hpi, CHD6-H3Kme3 y diagrama adjunto). Además, se aprecia un ligero aumento en la colocalización CHD6-H3K27me3 (de 45% a 55%), sin que se observen variaciones significativas en la colocalización CHD6-H3K4me3.

Los estudios in vivo e in vitro realizados muestran conjuntamente que durante la infección por el virus de la gripe se induce la asociación de CHD6 a marcadores característicos de cromatina transcripcionalmente inactiva.

Figura R16. Análisis de la asociación in vitro de NP y CHD6 con péptidos sintéticos de la cola de histona 3.

(A) Extractos nucleares de células HEK293T fueron pre- clareados con resina de avidina monomérica-agarosa. El material no pegado fue incubado con resinas a las que se acoplaron los siguientes péptidos sintéticos biotinilados: amino ácidos 1-21 de la cola de la histona 3 no metilado (H3(1-21)), o metilada en lisina 4 (H3K4me3) o lisina 9 (H3K9me3); aminoácidos 21-44 de la cola de la histona 3 no metilado (H3(22-44)), o metilado en lisina 27 (H3K27me3). Las resinas fueron lavadas extensamente y el material asociado a las mismas fue analizado por Western blot contra las proteínas CHD6, CHD3 y HP1α. (B) Similar a (A), pero utilizando extractos nucleares de células HEK293T infectadas con la cepa VIC y recogidas a 6 hpi.

et al., 2005a). Este posicionamiento genómico viral en la periferia de la célula infectada queda acentuada en células tratadas con leptomicina B en las que la exportación de las RNPs virales está bloqueada (Ma et al., 2001). Además, cuando se eliminan las RNPs solubles en células infectadas tratadas con detergentes, se observa claramente que las RNPs restantes presentan una localización periférica dentro del núcleo (Ma et al., 2001). Puesto que la distribución intranuclear de H3K9me3 es especialmente abundante en la periferia del núcleo (Payne & Braun, 2006; Zinner et al., 2006), y la asociación de CHD6 con este marcador se incrementa significativamente a tiempos tardíos de infección (Fig. R16-B y R17) junto a la nucleoproteína

NP viral en ensayos in vitro (Fig. R16-B), analizamos si las RNPs virales dentro del núcleo de la célula infectada están asociados con H3K9me3 junto a CHD6 in vivo. Para ello realizamos ensayos de colocalización mediante microscopía confocal. En células A549 infectadas con VIC se observa que, a 9 h post-infección, tanto NP como CHD6 se asocian con H3K9me3 (Fig. R18, paneles NP-H3K9me3 y H3K9me3-CHD6, respectivamente). Después, se obtuvieron imágenes de triple colocalización destacando únicamente las señales solapantes en las que se aprecia, y de forma concordante a lo ya visto in vitro, un cierto número de puntos de asociación CHD6-H3K9me3 que también contiene la proteína NP. Estos resultados sugieren,

Figura R17. Cambios en la asociación de CHD6 con lisinas metiladas de la cola de la histona 3 durante la infección viral. Células A549 fueron pseudo-

infectadas (MOCK) o infectadas con virus VIC a una MOI de 3 PFU/cel. A 9 hpi las células fueron fijadas y procesadas para la realización de ensayos de microscopía de Inmunofluorescencia confocal utilizando anticuerpo contra CHD6 junto a otro de los siguientes anticuerpos: anti-H3K4me3, anti-H3K9me3 o anti-H3K27me3. Los paneles CHD6-H3Kme3 muestran las señales de colocalización común para la pareja de anticuerpos correspondiente, y el panel adyacente presenta la imagen amplificada de la célula indicada con flecha. El experimento se realizó tres veces y se muestran imágenes representativas. La representación gráfica adjunta muestra la cuantificación del nivel de colocalización de células individuales provenientes de tres secciones distintas de tres experimentos independientes. Los asteriscos indican significación estadística determinada por la distribución de la T de student (*=p<0.05, **=p<0.0001).

infección por el virus de la gripe. Dada la capacidad de ambas por unir cromatina, y dada la ya descrita asociación entre CHD6 y las RNPs virales durante la infección, analizamos la implicación del remodelador de cromatina CHD6 en la asociación de las RNPs con H3K9me3. Para ello se realizaron experimentos de colocalización como los ya descritos, pero esta vez en infecciones de células A549 control (A549- TM) o establemente silenciadas para CHD6 (A549- siCHD6.2). Previo a este ensayo, se confirmó por Inmunofluorescencia que ninguna de las líneas celulares presenta alteraciones en los marcadores estudiados (datos no mostrados). Como se puede sin descartar la participación de otras proteínas

celulares y/o virales, que las RNPs virales podrían estar implicadas en el reclutamiento de CHD6 a sitios de cromatina inactiva.

4.4 CHD6 no media la asociación de NP con