APLICACIÓN DEL SOFTWARE DE MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA APLICADA A LA ETAPA DE RECEPCIÓN

DE LECHE DE LA EMPRESA LÁCTEOS PUCATE

En la Figura 1 se muestra la cinética de crecimiento de la bacteria E.coli en

15 Figura 1. Curvas de creci mi ento determi nada s a través de mi crobiología experi mental y predi ctiva (Combase) en función de a) Temperatura b) pH c)

NaCl (%) y d) Log UFC/mL de la Empresa Lácteos Pucate

En la Figura 1.a se puede observar que la curva de predicción que corresponde al crecimiento de E.coli a 37 ºC no tiene fase de latencia, esto podría deberse a que los modelos matemáticos del crecimiento microbiano no han logrado predecir con exactitud la fase de latencia de poblaciones de miles de microorganismos, dado que son muchos los factores que la controlan, es así que el modelo predictivo se concentra principalmente en la tasa de crecimiento exponencial (Aguirre, 2013). Al aumentar la temperatura de almacenamiento a 37 ºC, en la fase exponencial se observa que el crecimiento se inicia rápida y constantemente. De acuerdo con Madigan, Martinko, & Parker (2003), a medida que se eleva la temperatura, las reacciones químicas y enzimáticas de la célula son más rápidas y se produce el crecimiento más rápido.

16 La población final es de 8.6 log UFC/mL en 8 horas alcanzando el mismo valor cuando el pH es 6.64 en un tiempo de 26 horas, en estos dos casos la velocidad de crecimiento es de 3.68 y 0.97 (gen/h), respectivamente.

En la curva generada a partir de datos experimentales perteneciente al crecimiento de E.coli a 19.50 ºC, se puede observar que la fase de latencia apenas se distingue, por lo cual se asume que el microorganismo se adapta rápidamente al medio e inicia inmediata y constantemente su fase exponencial.

Se puede observar un crecimiento lento en la curva de predicción que corresponde al crecimiento de E.coli a 10 ºC, observándose que a las 48 h

aún continúa en fase de latencia, con una población final de 4 logUFC/mL. La

duración de la fase de latencia se ve afectada por los cambios en el medio fisicoquímico, como la temperatura, el pH y aw, el historial térmico y la

disponibilidad de nutrientes, entre otros factores (Aguirre, 2013). De acuerdo con Madigan, Martinko & Parker (2003), a muy bajas temperaturas, las membranas gelifican y las enzimas no operan a gran velocidad, el transporte de nutrientes es tan lento que no hay crecimiento.

Al modificar la concentración de cloruros (Figura 1.c), se observa que la curva de crecimiento generada por el software de predicción a una concentración de 0.500 %NaCl presentó un aumento en la duración de su fase de latencia en relación a las demás curvas de crecimiento con concentraciones de 0.020 %NaCl y 0.193 %NaCl respectivamente, en donde la duración de sus fases de latencia es menor. Resultados similares han sido observados por Robinson, Ocio, Kaloti, & Bernard (1998), quienes investigaron la duración de

la fase de adaptación en Listeria monocytogenes en relación con las

propiedades fisicoquímicas del medio de crecimiento, en donde la fase de latencia aumentó a medida que aumentaba la concentración de NaCl, así también pequeños cambios en la osmolalidad por encima de 3.0 NaCl OsM produjeron aumentos muy grandes de la fase de latencia.

En la curva de crecimiento proyectada a una concentración de 0.500 %NaCl,

se observa que la población final de E.coli es de 8.62 logUFC/mL en un lapso

de 30 horas, en tanto que la curva de crecimiento generada a una

concentración de 0.193 %NaCl la población final es de 8.64 logUFC/mL en

un tiempo de 27 horas, mientras que la curva de predicción a 0.020 %NaCl se observa que la población final es de 8.65 logUFC/mL en un período de 24 horas. La alteración en la concentración de %NaCl afecta directamente a la capacidad del microorganismo para adaptarse al medio (Prescott, Harley, & Klein, 2004).

Los datos experimentales indicaron una población inicial de E.coli de 2.54 log

UFC/mL que alcanzaría una concentración final de 8.64 logUFC/mL luego de

17 crecimiento es de 0.97 gen/h. Estos parámetros varían cuando se utiliza una población inicial de 1 log UFC/mL alcanzando a las 32.4 horas (1.4 días) de su crecimiento una concentración final de 8.6 log UFC/mL, la velocidad de crecimiento es de 0.97 gen/h. Mientras que si la concentración inicial de la bacteria en la leche cruda es de 5 log UFC/mL alcanzaría una concentración

final de 8.66 logUFC/mL luego de 16.4 horas (0.7 días), con una reducción de

la velocidad de crecimiento a 0.96 gen/h.

3.3 APLICACIÓN DEL SOFTWARE DE MICROBIOLOGÍA

PREDICTIVA APLICADA A LA ETAPA DE RECEPCIÓN

DE LECHE DE LA EMPRESA LÁCTEOS ESTELITA

En la Figura 2 se muestra la cinética de crecimiento de la bacteria E.coli en

leche crudapara diferentes condiciones de crecimiento.

Figura 2. Curvas de crecimiento determinadas a través de microbiología experimental y predictiva (Combase) en función de a) Temperatura b) pH c) NaCl (%) y d) Log UFC/mL de

18 Se puede observar un comportamiento similar a los resultados encontrados en la leche cruda de la empresa Pucate, en cuanto a la evolución de la

población de E.coli al aumentar o disminuir la temperatura, el pH, % de NaCl

o con las diferentes condiciones iniciales.

En relación a la variación de las diferentes condiciones de crecimiento tanto de pH, % de NaCl y de condiciones iniciales (Figuras 1.b, 1.c, 1.d) y su efecto sobre el crecimiento del microorganismo se observa un comportamiento similar en cuanto a las poblaciones finales alrededor de las 25 horas. En tanto que a 37º C el microorganismo crece más rápido con el aumento de la temperatura, la población final es de 8.66 log UFC/mL en un tiempo de 8 horas.

3.4 APLICACIÓN DEL SOFTWARE DE MICROBIOLOGÍA

PREDICTIVA APLICADA A LA ETAPA DE RECEPCIÓN

DE LECHE DE LA EMPRESA LÁCTEOS ADRIANITA

En la Figura 3 se muestra la cinética de crecimiento de la bacteria E.coli en

19 Figura 3. Curvas de creci mi ento determi nadas a través de mi crobiología experi mental y predi ctiva (Combase) en función de a) Temperatura b) pH c)

NaCl (%) y d) Log UFC/mL de l a Empresa Lácteos Adrianita

Como se observa en la Figura 3, los resultados son muy semejantes a los obtenidos para la empresa Pucate y Estelita.

La norma CSN 57 0529: 1993 fija el valor límite de E.coli para leche cruda de

vaca en 1.0x103 UFC/mL (Log 3), utilizando el software de predicción bajo las

condiciones a las que son expuestas las muestras, el tiempo en el que alcanzan el valor límite de E.coli es de 2.4 horas (0.1 días), 4 horas (0.2 días) y 1.4 horas (0.1 días) para las empresas Pucate, Estelita y Adrianita, respectivamente. De manera que constituye un riesgo para la calidad e inocuidad de los derivados que se procesen utilizando esta materia prima dado que el tiempo de vida útil estimado de una leche cruda es de 48 horas (2 días).

20

3.5

VELOCIDAD

DE

CRECIMIENTO

Y

TIEMPO

GENERACIONAL

Se aplicaron las ecuaciones 2 y 3 para obtener la velocidad de crecimiento (k)

y el tiempo generacional (g) del microorganismo, según se detalla en el literal 2.4. La Tabla 2 muestra el efecto de las diferentes condiciones (valor inicial del recuento, temperatura (ºC), pH y % NaCl) sobre estos dos parámetros de crecimiento.

Tabla 2. Cálculo de laVelocidad de Crecimiento y Tiempo generacional de E.coli

PUCATE ESTELITA ADRIANITA

k (gen/h) g (h/gen) k (gen/h) g (h/gen) k (gen/h) g (h/gen) Población inicial (UFC/mL) 5.00 0.96 1.04 1.08 0.93 1.58 0.63 2.00 - 2.60 0.97 1.03 1.10 0.91 1.60 0.62 1.00 0.97 1.03 1.10 0.91 1.60 0.63 Temperatura (°C) 37.00 3.68 0.27 3.69 0.27 3.65 0.27 19.00 - 23.00 0.97 1.03 1.10 0.91 1.61 0.62 10.00 0.12 8.03 0.12 8.09 0.13 7.95 pH 7.00 0.91 1.09 1.04 0.97 1.50 0.67 6.55 - 6.70 0.97 1.03 1.10 0.91 1.59 0.63 5.60 0.74 1.35 0.85 1.18 1.23 0.82 Cloruros (NaCl %) 0.50 0.84 1.19 0.96 1.05 1.37 0.73 0.19 - 0.30 0.96 1.04 1.09 0.92 1.59 0.63 0.02 1.10 0.91 1.26 0.80 1.84 0.54

Se puede observar en la Tabla 2 la relación proporcional entre estos dos parámetros de crecimiento, es decir, una mayor velocidad de crecimiento frente a un menor tiempo de generación. Resultados similares han sido observados por Dos Santos (2007), quién realizó un estudio del comportamiento cinético de microorganismos de interés en seguridad

alimentaria con modelos matemáticos, es así, que para Escherichia coli

CECT 516, se presentó una velocidad de crecimiento elevada (1.88 h-1), así

como un tiempo de generación bajo de (0.16 h), lo cual confirma la relación entre estos dos parámetros, una mayor velocidad de crecimiento versus menor tiempo de generación.

Conforme al estudio realizado la mejor combinación para predecir el

crecimiento de E.coli en cada una de las empresas fue 37 ºC, pH 6.64, 0.193

21 3.68 gen/h y tiempo de generación bajo de 0.27 (h) para la empresa Pucate. Para la empresa Estelita fue de 37 ºC, pH 6.55, 0.205 %NaCl y 2.00 log UFC/mL, con lo que se obtuvo una velocidad de crecimiento de 3.69 gen/h y tiempo generacional de 0.27 (h). Finalmente las condiciones para la empresa Adrianita fue de 37 ºC, pH 6.64, 0.199 %NaCl y 2.60 log UFC/mL con una velocidad de crecimiento y tiempo generacional de 3.65 gen/h, 0.27 (h), respectivamente. Por lo tanto bajo estas condiciones el microorganismo va a incumplir la norma lo más rápido posible, dado a la alta velocidad de crecimiento del microorganismo, por lo cual es importante controlar factores como la temperatura, pH y concentración de cloruros que influyen en el crecimiento de esta bacteria.

Determinar el tiempo de generación es importante, ya que, es el tiempo que tardan las células microbianas en duplicarse, y es útil como indicador del estado fisiológico de una población celular (Dos Santos, 2007), por lo tanto cualquier cambio del medio que prolongue el tiempo de generación extenderá el tiempo de conservación del alimento y una mayor vida útil del mismo. Se puede observar también cómo a mayor población inicial (Log UFC/mL), la velocidad de crecimiento disminuye, por el contrario a una menor población inicial (Log UFC/mL), la velocidad de crecimiento aumenta.

Con respecto al parámetro de temperatura se puede observar en la Tabla 2, como a una mayor temperatura la velocidad de crecimiento aumenta. Esto se debe a que el metabolismo en general es más activo a temperaturas altas y el microorganismo crece más rápidamente con el aumento de temperatura, pero a partir de cierto punto un mayor aumento disminuye la velocidad de crecimiento, y temperaturas más altas llegan a ser letales dado que ocasionan daños a los microorganismos al desnaturalizar las enzimas, las proteínas transportadoras, y otras proteínas (Prescott, Harley, & Klein, 2004). Confirmando el efecto de la temperatura sobre la viabilidad y el crecimiento microbiano.

Con respecto al pH, se puede observar en la Tabla 2, una mayor velocidad de crecimiento con valores de pH comprendidos entre 6.55 – 6.70, por otra parte a un pH de 5.60 la velocidad de crecimiento es menor.

En cuanto a la concentración de cloruro de sodio, se evidenció como la velocidad de crecimiento disminuye con el incremento de la concentración de sal. Este comportamiento es similar al descrito por Robinson, Ocio, Kaloti, & Bernard (1998), en donde una osmolalidad aumentada, redujo la tasa de crecimiento. En tanto que a una baja concentración de cloruro de sodio, la velocidad de crecimiento aumenta.

En consecuencia la velocidad de crecimiento y el tiempo de generación, están influenciadas por las condiciones ambientales (temperatura, composición del

22 medio de cultivo, etc.) así como por las carácterísticas genéticas del organismo.