UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA
E INDUSTRIAS
CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA APLICADA
A LA ETAPA DE RECEPCIÓN DE LECHE EN 3 EMPRESAS DE
ASOPROLAM
TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO
DE INGENIERA DE ALIMENTOS
MARIELA KARINA GUACHO BRAVO
DIRECTOR: ING. CARLOS GONZÁLEZ MSc.
FORMULARIO DE REGISTRO BIBLIOGRÁFICO
PROYECTO DE TITULACIÓN
DATOS DE CONTACTO
CÉDULA DE IDENTIDAD: 172438968-7
APELLIDO Y NOMBRES: Guacho Mariela Karina
DIRECCIÓN: Barrio Bella Aurora Calle B-LT12
EMAIL: [email protected]
TELÉFONO FIJO: 3474417
TELÉFONO MOVIL: 0979033203
DATOS DE LA OBRA
TÍTULO: MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA
APLICADA A LA ETAPA DE RECEPCIÓN DE LECHE EN 3 EMPRESAS DE ASOPROLAM
AUTORA: Mariela Karina Guacho Bravo
FECHA DE ENTREGA DEL PROYECTO
DE TITULACIÓN: Junio, 2017
DIRECTOR DEL PROYECTO DE TITULACIÓN:
Ing. Carlos González MSc.
PROGRAMA PREGRADO POSGRADO TITULO POR EL QUE OPTA: Ingeniera de Alimentos
RESUMEN: El objetivo del presente trabajo fue aplicar microbiología predictiva a la etapa de recepción de leche en 3 empresas de la asociación de productores lácteos de Machachi ASOPROLAM con el fin de predecir el crecimiento de E.coli en la leche
cruda mediante el paquete
informático Combase. El muestreo se realizó tomando una muestra de leche cruda por cada empresa en la etapa de recepción de leche. Las muestras se recolectaron en frascos estériles, se midió el pH y la temperatura in situ. Las muestras se
trasladaron a temperaturas de
refrigeración hacia los laboratorios para los respectivos análisis. Se realizó la determinación de acidez, concentración de cloruros (% NaCl) y de la población de E. coli, mediante placas Compact Dry EC y según el método estándar de conteo de placas AOAC 966.23. En la medición de pH in situ los resultados obtenidos indican que la leche de las tres empresas se encuentra dentro del rango de pH óptimo de 6.5-6.65; no
obstante, ninguna de las tres
empresas cumplió con los límites establecidos de acidez y cloruros, corroborados en las normas de leche cruda. El recuento microbiológico de
E.coli indica que las tres empresas cumplen con los límites permisibles de leche cruda siendo este de 1.0 x103 UFC/mL. Se pudo predecir el tiempo en el que la leche cruda alcanzaría el valor límite de E.coli
(1.0x103 UFC/mL) correspondiendo a
2.4 horas (0.1 días), 4 horas (0.2 días) y 1.4 horas (0.1 días) para las
empresas Pucate, Estelita y
Adrianita, respectivamente,
constituyendo un riesgo para la calidad e inocuidad de los derivados que se procesen utilizando esta materia prima. La velocidad de
crecimiento y el tiempo de
generación, pueden verse
significativamente afectados por las
condiciones ambientales
(temperatura y composición del medio de cultivo), cuanto más favorables sean las condiciones, mayor será el crecimiento.
ABSTRACT: The aim of the present work was to apply predictive microbiology to the
stage of milk reception in 3
companies of the association of dairy
producers of Machachi
ASOPROLAM and to predict the growth of E.coli in raw milk using the Combase software. Sampling was performed by taking a sample of raw milk per company at the stage of milk reception. Samples were collected in sterile flasks, pH and temperature were measured in situ. Samples were transferred to refrigeration temperatures towards the laboratory
for analyses. Determination of
acidity, chloride concentration (% NaCl) and the E.coli population using
Compact Dry EC plates and
according to the standard method of plate count AOAC 966.23. In pH
measurement in situ the results
obtained indicate that the milk of the three companies are within the optimum pH range of 6.5-6.65;
however, none of the three
companies complied with the limits established of acidity and chlorides, corroborated in raw milk standards.
E. coli microbiological count indicates that three companies comply with the permissible limits of raw milk being 1 x103 CFU/mL. It was possible to predict the time in which raw milk would reach the maximum value of
E. coli (1.0x103 CFU/mL)
corresponding to 2.4 hours (0.1 days), 4 hours (0.2 days) and 1.4 hours (0.1 days) for the companies
Pucate, Estelita and Adrianita,
and the generation time can be
significantly affected by the
environmental conditions
(temperature and composition of the culture medium), the more favorable the conditions, the greater the growth.
KEYWORDS Predictive Microbiology, E. coli, milk, growth rate, generation time.
DECLARACIÓN Y AUTORIZACIÓN
Yo, MARIELA KARINA GUACHO BRAVO, CI 172438968-7 autora del
proyecto titulado: “Microbiología predictiva aplicada a la etapa de
recepción de leche en 3 empresas de ASOPROLAM” previo a la obtención
del título de Ingeniera de Alimentos en la Universidad Tecnológica
Equinoccial.
1. Declaro tener pleno conocimiento de la obligación que tienen las Instituciones de Educación Superior, de conformidad con el Artículo 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior, de entregar a la SENESCYT en formato digital una copia del referido trabajo de graduación para que sea integrado al Sistema Nacional de información de la Educación Superior del Ecuador para su difusión pública respetando los derechos de autor.
2. Autorizo a la BIBLIOTECA de la Universidad Tecnológica Equinoccial a tener una copia del referido trabajo de graduación con el propósito de generar un Repositorio que democratice la información, respetando las políticas de propiedad intelectual vigentes.
Quito, 04 de abril de 2017
CARTA DE AUTORIZACIÓN
DECLARACIÓN
Yo Mariela Karina Guacho Bravo, declaro que el trabajo aquí descrito es de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas que se incluyen en este documento.
CERTIFICACIÓN
Certifico que el presente trabajo que lleva por título “Microbiología
predictiva aplicada a la etapa de recepción de leche en 3 empresas de ASOPROLAM”, que, para aspirar al título de Ingeniera de Alimentos fue
desarrollado por Mariela Karina Guacho Bravo, bajo mi dirección y
supervisión, en la Facultad de Ciencias de la Ingeniería e Industrias; y cumple con las condiciones requeridas por el reglamento de Trabajos de Titulación artículos 19, 27 y 28.
Ing. Carlos González MSc. DIRECTOR DEL TRABAJO
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTO
En el presente trabajo de tesis me gustaría agradecer en primer lugar a Dios, por haber estado conmigo en los momentos que más lo necesitaba, cuidándome y dándome fortaleza para continuar y poder llegar a cumplir este sueño tan anhelado.
A mis padres, Carlos y Enma, por haber estado conmigo apoyándome en los momentos más difíciles, por dedicar tiempo y esfuerzo para ser una mujer de bien. Su lucha y tenacidad insaciable han hecho de ellos el gran ejemplo a seguir y destacar, para mí y mis hermanos.
A mis hermanos, Carlos, Michael y Kevin, por comprenderme, por cuidarme y preocuparse tanto. Los amo mucho.
A Lizbeth, por su amistad incondicional, por estar siempre cerca de mí y por todas las palabras de aliento. Has sido un ángel para mí.
A mis amigas y amigos, Karina, Michelle, Yessy, Betsy, Mayra, Xavier y Pablo, por cada risa y locura compartida durante el transcurso de mi vida universitaria. Me llevo los más lindos recuerdos de estos 5 años, aprendí también mucho de ustedes y sin importar a donde nos dirija el destino, siempre los llevaré en mi corazón.
A Carlos González, mi director, gracias por su apoyo durante la realización de este trabajo y por sus conocimientos transmitidos.
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ÍNDICE DE CONTENIDOS
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RESUMEN 1
ABSTRACT 2
1. INTRODUCCIÓN 3
2. METODOLOGÍA 9
2.1. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS 9
2.1.1 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA E INOCULACIÓN 9 2.1.2 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 9 2.2. ANÁLISIS FÍSICO QUÍMICOS DE LA LECHE 10 2.2.1 DETERMINACIÓN DE pH 10 2.2.2 DETERMINACIÓN DE LA TEMPERATURA 10 2.2.3 DETERMINACIÓN DE CLORURO DE SODIO EN LA LECHE 10 2.2.4 DETERMINACIÓN DE ACIDEZ EN LECHE 11 2.3 APLICACIÓN DE MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA APLICADA A LA ETAPA DE RECEPCIÓN DE LECHE 11
2.4 USO DEL SOFTWARE DE PREDICCIÓN 12 2.5 VELOCIDAD DE CRECIMIENTO Y TIEMPO GENERACIONAL 12 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 13 3.1 PARÁMETROS FÍSICO QUÍMICOS Y MICROBIOLÓGICOS DE LAS EMPRESAS DE ASOPROLAM 13
3.2 APLICACIÓN DEL SOFTWARE DE MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA APLICADA A LA ETAPA DE RECEPCIÓN DE LECHE DE LA EMPRESA LÁCTEOS PUCATE 14
3.3 APLICACIÓN DEL SOFTWARE DE MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA APLICADA A LA ETAPA DE RECEPCIÓN DE LECHE DE LA EMPRESA LÁCTEOS ESTELITA 17
3.4 APLICACIÓN DEL SOFTWARE DE MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA APLICADA A LA ETAPA DE RECEPCIÓN DE LECHE DE LA EMPRESA LÁCTEOS ADRIANITA 18 3.5 VELOCIDAD DE CRECIMIENTO Y TIEMPO GENERACIONAL 20 4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 23
4.1 CONCLUSIONES 23
4.2 RECOMENDACIONES 24 5. BIBLIOGRAFÍA 25
ii
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 1. Parámetros Físico químicos y Microbiológicos de la leche cruda
de las Empresas de ASOPROLAM 13
Tabla 2. Cálculo de la Velocidad de Crecimiento y Tiempo generacional
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ÍNDICE DE FIGURAS
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iv
ÍNDICE DE ANEXOS
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Anexo 1. Recolección de muestras en la etapa de recepción 28
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RESUMEN
El objetivo del presente trabajo fue aplicar microbiología predictiva a la etapa de recepción de leche en 3 empresas de la asociación de productores lácteos de Machachi ASOPROLAM con el fin de predecir el crecimiento de
E.coli en la leche cruda mediante el paquete informático Combase. El muestreo se realizó tomando una muestra de leche cruda por cada empresa en la etapa de recepción de leche. Las muestras se recolectaron en frascos estériles, se midió el pH y la temperatura in situ. Las muestras se trasladaron a temperaturas de refrigeración hacia los laboratorios para los respectivos análisis. Se realizó la determinación de acidez, concentración de cloruros (%
NaCl) y de la población de E. coli, mediante placas Compact Dry EC y según
el método estándar de conteo de placas AOAC 966.23. En la medición de pH
in situ los resultados obtenidos indican que la leche de las tres empresas se encuentra dentro del rango de pH óptimo de 6.5-6.65; no obstante, ninguna de las tres empresas cumplió con los límites establecidos de acidez y cloruros, corroborados en las normas de leche cruda. El recuento
microbiológico de E.coli indica que las tres empresas cumplen con los límites
permisibles de leche cruda siendo este de 1.0x103 UFC/mL. Se pudo predecir
el tiempo en el que la leche cruda alcanzaría el valor límite de E.coli (1.0x103 UFC/mL) correspondiendo a 2.4 horas (0.1 días), 4 horas (0.2 días) y 1.4 horas (0.1 días) para las empresas Pucate, Estelita y Adrianita, respectivamente, constituyendo un riesgo para la calidad e inocuidad de los derivados que se procesen utilizando esta materia prima. La velocidad de crecimiento y el tiempo de generación, pueden verse significativamente afectados por las condiciones ambientales (temperatura y composición del medio de cultivo), cuanto más favorables sean las condiciones, mayor será el crecimiento.
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ABSTRACT
The aim of the present work was to apply predictive microbiology to the stage of milk reception in 3 companies of the association of dairy producers of
Machachi ASOPROLAM and to predict the growth of E.coli in raw milk using
the Combase software. Sampling was performed by taking a sample of raw milk per company at the stage of milk reception. Samples were collected in sterile flasks, pH and temperature were measured in situ. Samples were transferred to refrigeration temperatures towards the laboratory for analyses.
Determination of acidity, chloride concentration (% NaCl) and the E.coli
population using Compact Dry EC plates and according to the standard method of plate count AOAC 966.23. In pH measurement in situ the results obtained indicate that the milk of the three companies are within the optimum pH range of 6.5-6.65; however, none of the three companies complied with the limits established of acidity and chlorides, corroborated in raw milk
standards. E. coli microbiological count indicates that three companies comply
with the permissible limits of raw milk being 1.0x103 CFU/mL. It was possible
to predict the time in which raw milk would reach the maximum value of E. coli
(1.0x103 CFU/mL) corresponding to 2.4 hours (0.1 days), 4 hours (0.2 days) and 1.4 hours (0.1 days) for the companies Pucate, Estelita and Adrianita, respectively, constituting a risk for the quality and safety of the derived products that are processed using this raw material. The growth rate and the generation time can be significantly affected by the environmental conditions (temperature and composition of the culture medium), the more favorable the conditions, the greater the growth.
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1. INTRODUCCIÓN
Un grave problema de salud pública son las enfermedades trasmitidas por alimentos (ETAs); la Organización Mundial de la Salud (OMS) publicó en el año 2015 que 77 millones de personas en América Latina se enferman cada año por ingerir alimentos contaminados; entre las bacterias más comunes
están las especies de los géneros Campylobacter, Salmonella y la cepa
0157:H7 de la enterobacteria E.coli, (González & Rojas, 2005) las cuales causan principalmente el 95 % de enfermedades a través de alimentos. Este problema incide más en países en vías de desarrollo en donde las estrategias para el control de la inocuidad de los alimentos son poco conocidas y puestas en práctica con ciertas dificultades. La inocuidad de los alimentos y su calidad nutricional son elementos que influyen en la calidad de vida de las personas así como en su salud; precisamente la implementación de normas, programas y métodos prácticos como por ejemplo el Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (HACCP) y el uso de la Microbiología Predictiva ayudan a la prevención de riesgos a través de microorganismos. Los principales alimentos que están implicados en los brotes de ETAs pertenecen a pescados y productos de la pesca, platos preparados (rápidos), productos cárnicos y productos lácteos (Alerte, y otros, 2012).
A nivel mundial la leche de vaca representa la gran mayoría de la leche procesada para el consumo humano, se valora que la población mundial
consume anualmente alrededor de 500 millones de toneladas
correspondiente a leche en diversas presentaciones para alimento humano, el 85 % pertenece a leche de vaca y el resto a otras especies como búfala, cabra y otras. En las últimas décadas el consumo de leche y sus derivados ha ido aumentando especialmente en los países en desarrollo. A nivel mundial su consumo es alto, dado que proporciona nutrimentos indispensables para el ser humano, por lo cual se considera a la leche de vaca como un alimento de primera necesidad, además, es considerada imprescindible para cada etapa de la vida empezando desde el embarazo, durante la lactancia, el crecimiento así como en la población de edad avanzada (Dapcich, Salvador, Ribas, Pérez, Aranceta, & Serra, 2004).
4 fuente importante de patógenos que afectan sus propiedades organolépticas y fisicoquímicas (Milke, y otros, 2011). La leche cruda es altamente perecedera dado que por la acción de enzimas naturales y microorganismos contaminantes se descompone rapidamente, así como también puede abarcar microorganismos patógenos y por ende implicar un riesgo para la salud a quien la consume en dicho estado, por tal motivo es sometida a tratamientos térmicos u otros procesos para garantizar su inocuidad.
La leche de buena calidad es aquella que tiene buena apariencia, está libre de adulteraciones y alcanza un bajo recuento bacteriano (Moreno, Rodríguez, Méndez, Osuna, & Vargas, 2007). La leche para consumo humano debe estar libre de microorganismos patógenos, sedimentos y materias extrañas o nocivas, y tener bajo conteo bacteriano total. La calidad de la leche no sólo tiene que ver con sus características organolépticas, se relaciona también con un conteo bacteriano que es la prueba utilizada con mayor frecuencia para determinar su calidad (Mariscal, Ibáñez, & Gutiérrez, 2013).
El origen de la contaminación microbiana de la leche se debe a fuentes tanto de la ubre, como del medio ambiente y el equipo de ordeño (Magariños, 2001), siendo el proceso de ordeño, la fuente de contaminación más importante y variable, dado al aporte de un gran número de microorganismos con diferentes propiedades microbiológicas, por ejemplo: una incorrecta higiene de las ubres de la vaca, ya que, puede contener cierta cantidad de tierra y estiércol, llegando abarcar una gran cantidad de bacterias y muchas de ellas pueden ser microorganismos patógenos. La inadecuada limpieza y desinfección del equipo de ordeño es la principal razón de la flora Gram negativa psicotrófica en la leche cruda, dentro de este grupo microbiano, el
género de las Pseudomonas (50 %) es el más frecuente reportado (Signorini,
y otros, 2008). A su vez la incidencia de coliformes como Enterobacter y
E.coli en la leche cruda han recibido notable atención, ya que, están asociadas con la contaminación procedente de origen fecal y el peligro de otras bacterias patógenas asociadas a las heces. Sin embargo, en la actualidad se considera que la presencia de coliformes en la leche cruda no es evidencia de contaminación fecal directa, estas pueden formarse en residuos húmedos y lácteos (biopelículas) en los instrumentos de ordeño y posteriormente convertirse en una fuente importante de contaminación en leche recolectada (Robinson, 2002).
La E.coli es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo, no esporulado, pertenece a la familia Enterobacteriaceae (Rodríguez, 2002), se encuentra normalmente en el tracto gastrointestinal de los seres humanos y animales, es el mejor indicador de contaminación de materia fecal en los alimentos. Hay distintos tipos de E.coli patógena que producen diferentes toxinas y distintos
síntomas que causan enfermedades graves, como la E.coli O157:H7 a la cual
5 caracteriza por daño renal agudo. Asimismo se debe conocer que existe E-coli genérica o biotipo 1 no patógena, y es habitante normal del intestino (Michanie, 2003). La principal vía de exposición de E.coli hacia las personas, es el consumo de alimentos contaminados, como carne molida cruda o mal cocida, leche cruda o productos frescos (FAO, 2011), así también el consumo de alimentos como hamburguesas, roast beef, agua de pozos, jugo de manzana no pasteurizado (pH 3,5), yogurt, salame, quesos, entre otros, han estado involucrados en brotes de enfermedades causadas por este microorganismo.
Moreno, Rodríguez, Méndez, Osuna y Vargas realizaron una caracterización de la calidad higiénica y sanitaria de la leche cruda en la cuenca del Alto Chicamocha en el departamento de Boyacá (Colombia) en el año 2007, se
evaluó recuentos de Células Somáticas, Mesófilos, Staphylococcus,
Coliformes y Listeria en 34 Sistemas de Producción lecheros registrados en la Federación de Ganaderos de Boyacá, en dos épocas del año. La toma de muestras de leche se efectuó al momento del primer ordeño, se recogió una muestra de las cantinas (pool) o del tanque de la Finca y posteriormente se envió al laboratorio. En cuanto al Recuento de Células Somáticas (RCS) en la leche, se registró promedios significativos, en el segundo muestreo en comparación con el primero, es decir, que se presentó una mayor invasión de bacterias en la ubre, señalando que las células somáticas aumentan por causas como la mastitis, cambios en la higiene ambiental y en el clima así como también en el funcionamiento del sistema de ordeño. Existe también en el RCS una relación significativa entre la desinfección antes del ordeño y el secado de los pezones, que puede deberse a las malas condiciones higiénicas de los establos, falta de higiene en las manos del personal y la falta de implementación de prácticas de higiene previo al ordeño. La leche cruda es recolectada principalmente en cantinas en donde la temperatura a la cual se expone no es la adecuada, lo cual favoreció a la multiplicación de
microorganismos contaminantes como mesófilos y coliformes. Hay una
relación significativa directa entre el recuento de mesófilos y de coliformes lo que indica contaminación en la leche por el medio ambiente, la presencia de estas bacterias indican un deficiente manejo higiénico de la rutina de ordeño y exposición de la leche a material fecal. El secado de pezones y el recuento de
coliformes presentan una relación significativa, se obtuvo un mayor resultado en los sistemas productivos que no secan con respecto a los que secan, dado que la piel húmeda aporta más cantidad de bacterias que la piel seca, por lo cual el secado de los pezones benefició considerablemente en el recuento de
coliformes. En tanto al recuento de aerobios mesófilos y Staphylococcus spp.
6 El proceso de recolección y transporte, así como también durante la recepción y almacenamiento representan fuentes de contaminación para la leche cruda (Magariños, 2001). Durante el proceso de obtención de leche se consideran varias etapas, siendo los puntos críticos de control más significativos; la recepción de la leche cruda, pasteurización y distribución (Hernández, 2011). En la etapa de recepción se debe controlar la existencia de microorganismos patógenos, a través de la aplicación de buenas prácticas de higiene en las instalaciones de la finca, de este modo se frena la entrada de leche con un elevado recuento de microorganismos. El proceso de pasteurización reduce la población de microorganismos patógenos en la leche; sin embargo, no la vuelve estéril completamente. En la industria láctea las bacterias termodúricas son capaces de sobrevivir a altas temperaturas principalmente las de pasteurización, a este grupo de bacterias pertenecen diferentes grupos microbianos e incluyen cepas de los géneros
Microbacterium, Micrococcus, Alcaligenes así como también bacterias formadoras de esporas perteneciente a los géneros Bacillus y Clostridium
(Robinson, 2002), su termoresistencia supone que pueden estar presentes en el producto final; por lo cual durante este proceso el control de parámetros como temperatura y tiempo deben ser apropiados para evitar un número elevado de supervivencia de microorganismos patógenos. En tanto, que en el proceso de distribución mantener la cadena de frío es fundamental para evitar el crecimiento de microorganismos (Galván, 2005).
La leche es un ideal medio de cultivo para distintos microorganismos debido a su alta actividad de agua, su pH cercano a neutro y su riqueza en nutrientes, ocasionando que en la llegada de los mismos se genere un proceso de adaptación y crecimiento en el medio. El crecimiento ocasiona un aumento de los componentes celulares del microorganismo, ya sea un incremento de su tamaño o del número de su población, o de ambos (Prescott, Harley, & Klein, 2004). El ciclo de crecimiento de una población de microorganismos se estudia analizando la curva de crecimiento de un cultivo microbiano, la cual consta de cuatro fases diferentes denominadas fase de latencia, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte. Cuando se analiza una curva de crecimiento bacteriano, el tiempo de latencia y la fase de crecimiento exponencial son los más importantes para la evaluación del crecimiento de un microorganismo (Valík, Medveďová, Bajúsová, & Liptáková, 2008).
7 factores extrínsecos que pertenecen a las condiciones de almacenamiento y a las condiciones ambientales (por ejemplo: temperatura, composición del aire, etc). Entre los principales factores que se destinguen en el control del crecimiento microbiano en los alimentos se encuentran: la temperatura, pH,disponibilidad de agua y oxígeno. La temperatura es uno de los factores más importantes que afecta intensamente a la viabilidad y al crecimiento de los microorganismos. El factor que más influye sobre el efecto de la temperatura en el crecimiento es la termosensibilidad de las enzimas (Prescott, Harley, & Klein, 2004). El pH de un medio tiene gran influencia sobre el crecimiento microbiano, cada especie de microorganismos tiene un rango de pH definido de crecimiento y un pH óptimo, la mayoría de los ambientes naturales tienen un valor de pH entre 5-9, siendo este el más común para el desarrollo de microorganismos. La mayoría de bacterias son neutrófilos es decir toleran rangos de pH comprendidos entre 5.5 y 8.0, el pH no solo limita el crecimiento microbiano en los alimentos sino también a su tasa de supervivencia durante su almacenamiento y los diferentes tratamientos de conservación (Madigan, Martinko, & Parker, 2003). La actividad de agua es la disponiblidad de agua en los alimentos y es uno de los principales factores para el crecimiento microbiano. La mayoría de
microorganismos crecen en medios con una actividad de agua (aw) cercana a
0.98. La presencia de oxígeno influye en el tipo de microorganismos que pueden crecer en un alimento, algunos de ellos pueden crecer en presencia de O2 atmosférico (aerobio) y otros en ausencia del mismo (anaerobio), la
mayoría de microorganimos que son de importancia pública en los alimentos son facultativos, es decir que pueden crecer tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas (Madigan, Martinko, & Parker, 2003).
La microbiología predictiva estudia la descripción de las respuestas microbianas en diferentes condiciones físicas y químicas como temperatura, pH y actividad de agua, empleando modelos matemáticos, para predecir el crecimiento o disminución de microorganismos bajo condiciones ambientales especificadas; con el fin de prevenir el deterioro de alimentos y enfermedades transmitidas por los mismos. Actualmente se conocen tres tipos de modelos matemáticos orientados a la microbiología predictiva: modelos primarios, modelos secundarios y modelos terciarios (Whiting, 1995).
8 son los modelos primarios más utilizados para la descripción del crecimiento microbiano (Valík, Medveďová, Bajúsová, & Liptáková, 2008).
Los modelos secundarios indican cómo cambian los parámetros que pueden aparecer en los modelos primarios, en función de las condiciones del medio, como la temperatura, pH o aw. La ecuación superficial de respuesta, la
relación de Arrhenius y el modelo de raíz cuadrada son algunos ejemplos de este tipo de modelos (Fakruddin, Mohammad, & Shahnewaj Bin Mannan, 2011).
Los modelos terciarios combinan los dos primeros tipos de modelos (primario y secundario) e incorporan el desarrollo de softwares fáciles de usar y herramientas computacionales que calculan el comportamiento microbiano en las condiciones especificadas (Whiting, 1995).
El objetivo del presente trabajo fue aplicar microbiología predictiva a la etapa de recepción de leche en 3 empresas de ASOPROLAM. Se plantearon los siguientes objetivos específicos: medir el pH y la temperatura de las muestras
in situ, determinar la acidez, %NaCl y población de E.coli en las muestras
recolectadas y predecir el crecimiento de E. coli usando el paquete
9
2. METODOLOGÍA
Se tomaron muestras de leche cruda procedentes de la etapa de recepción de 3 empresas de la asociación de productores lácteos de Machachi ASOPROLAM ubicada en el cantón Mejía de la Provincia de Pichincha, de acuerdo a la Norma INEN 1529-2 (1999): Control microbiológico de los alimentos toma, envío y preparación de muestras para el análisis microbiológico. Se determinó las condiciones del proceso in situ, a todas las muestras, se midió el pH y la temperatura. Las muestras se las conservaron en refrigeración y posteriormente se las trasladó rápidamente hacia los laboratorios de Microbiología y Química Analítica de la Universidad Tecnológica Equinoccial.
Se determinó acidez, cloruros (%NaCl) y población de E.coli mediante
métodos rápidos con la utilización de placas Compact Dry EC. Se empleó un software de crecimiento microbiano denominado ComBase Predictor, para predecir el crecimiento de E. coli.
2.1. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS
Se realizó análisis de E.coli en el laboratorio de Microbiología de la Universidad Tecnológica Equinoccial.
2.1.1 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA E INOCULACIÓN
Se realizaron diluciones sucesivas para cada análisis microbiológico, según la Norma INEN 1529-2 (1999), donde se tomó 10 ml de la muestra y se transfirió a un frasco con 90 ml de agua peptonada al 0.1 %, la muestra (solución inicial
10-1) se homogenizó con la ayuda de un vortex por 10 segundos, y a partir de
ésta se realizaron diluciones 10-2,10-3 y10-4, de las cuales se mezcló 1 ml de la muestra y 9 ml del diluyente (agua peptonada bufferada estéril). Se inoculó en las placas Compact Dry EC en las cuales se colocó 1 ml de la muestra en el centro de la placa y se incubó por 24 a 48 horas a una temperatura de 37 +/- 2 °C, en posición invertida. Los ensayos se realizaron por duplicado.
2.1.2 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
10
determinar el crecimiento de E.coli se aplicó el Método estándar de conteo de
placas AOAC 966.23. Los resultados se expresaron como Log UFC/mL.
2.2. ANÁLISIS FÍSICO QUÍMICOS DE LA LECHE
Se llevó a cabo el análisis de los parámetros físico químicos de la leche, necesarios para obtener datos experimentales e introducirlos en el software de microbiología predictiva ComBase Predictor.
2.2.1 DETERMINACIÓN DE pH
Se determinó el pH in situ, en la etapa de recepción de la leche en cada empresa. La muestra de leche se colocó en un frasco completamente estéril, se introdujo el potenciómetro portátil (HANNA instruments) y se tomó la medida.
2.2.2 DETERMINACIÓN DE LA TEMPERATURA
Se determinó la temperatura in situ, en la etapa de recepción de la leche en cada empresa. La muestra de leche se colocó en un frasco completamente estéril, se introdujo el termómetro y se tomó la medida.
2.2.3 DETERMINACIÓN DE CLORURO DE SODIO EN LA
LECHE
Para determinar el contenido de cloruros (NaCl) se tomaron 5 ml de muestra y se colocó en un Erlenmeyer, se agregaron 2 ml de K2CrO4 al 5 % y se
mezcló para homogenizar la muestra, tornándose de un color amarillo claro. Se colocó en una bureta una solución de AgNO3 0.1 N y gota a gota se
agregó al Erlenmeyer, se agitó constantemente hasta llegar a una coloración ligeramente parda. El análisis para la determinación de cloruros se realizó por
duplicado. Se anotó en cada titulación el volumen de AgNO3 0.1 N
consumido. Se realizó nuevamente el mismo procedimiento de titulación antes descrita pero sin la muestra, el cual se denominó ensayo en blanco, para realizar los diferentes cálculos. Según la ecuación 1.
11
2.2.4 DETERMINACIÓN DE ACIDEZ EN LECHE
Se tomó 10 ml de leche y se colocó en un Erlenmeyer, posteriormente se añadió 4 gotas de fenolftaleína en la muestra. Se colocó en una bureta una solución de NaOH 0.1 N y gota a gota se agregó al Erlenmeyer, se agitó constantemente hasta llegar a un color ligeramente rosado. El análisis para la determinación de acidez se realizó por duplicado. Se anotó en cada titulación el volumen de NaOH 0.1 N consumido, para los correspondientes cálculos, de acuerdo a la ecuación 2.
Donde:
V= Volumen NaOH consumido N= Normalidad NaOH
M= Volumen de muestra
2.3
APLICACIÓN
DE
MICROBIOLOGÍA
PREDICTIVA
APLICADA A LA ETAPA DE RECEPCIÓN DE LECHE
Para la predicción del crecimiento de E.coli en leche cruda; se eligieron las siguientes condiciones de crecimiento para las tres empresas: se utilizó una temperatura de 37 ºC (temperatura óptima de crecimiento) y una temperatura de 10 ºC (temperatura de refrigeración) (Ramos, 1994), también se utilizó un pH máximo de 7.00 (Negri, 2005) y un pH de mínimo 5.60 (Salazar, 2013), que son condiciones normales de pH que puede presentar una leche, asimismo se usó una concentración de cloruros máxima y mínima de 0.500 y 0.020 (% NaCl), estas concentraciones de NaCl se estimaron de acuerdo a la norma venezolana para leche cruda COVENIN 903-93 y finalmente se utilizó una población máxima de 5 UFC/mL, el cual es un valor doble estimado del crecimiento de la población inicial real y para el crecimiento mínimo al menos debe haber 1 UFC/mL. De tal manera que se pueda diferenciar la tendencia de crecimiento.
Se predijo el crecimiento de E.coli en leche cruda durante 2 días (48 horas),
se utilizó este tiempo debido a la vida útil de la leche cruda sin ser sometida a ningún tratamiento previo.
12
2.4 USO DEL SOFTWARE DE PREDICCIÓN
Se ingresaron los datos en el programa informático Combase, el cual predijo el crecimiento de la bacteria bajo condiciones encontradas en las muestras y bajo condiciones propuestas con el fin de comparar el comportamiento de la bacteria.
2.5
VELOCIDAD
DE
CRECIMIENTO
Y
TIEMPO
GENERACIONAL
Se aplicaron las ecuaciones 3 y 4 para obtener la velocidad de crecimiento (k)
y el tiempo generacional (g) del microorganismo en estudio.
Para la velocidad de crecimiento se utilizó la ecuación 3.
Donde:
N0= Número inicial de células
Nf= Número final de células
t = Horas o minutos del crecimiento exponencial
Para el tiempo generacional se utilizó la ecuación 4.
Donde:
k = velocidad de crecimiento
13
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 PARÁMETROS FÍSICO QUÍMICOS Y MICROBIOLÓGICOS
DE LAS EMPRESAS DE ASOPROLAM
En la Tabla 1 se detallan los valores obtenidos de los parámetros físico químicos y microbiológicos que se realizaron en la leche cruda aplicados en el software de microbiología predictiva (Combase).
Tabla 1. Parámetros Físico químicos y Microbiológicos de la leche cruda de las Empresas de ASOPROLAM
EMPRESA pH CLORUROS (NaCl %) ACIDEZ (%) (Log UFC/mL) E.coli
Pucate 6.64 0.193 0.018 2.54
Estelita 6.55 0.205 0.017 2.00
Adrianita 6.64 0.199 0.015 2.60
En la Tabla 1 se puede observar los resultados obtenidos de la toma de pH in
situ en cada una de las empresas de ASOPROLAM, los cuales entran en el
rango de pH óptimo de 6.55–6.64. De acuerdo con Celis & Juárez (2009), el pH de la leche es de característica cercana a la neutra, el cual puede variar entre 6.5 y 6.65.
Celis & Juárez (2009), indican que valores distintos al pH óptimo se producen por un deficiente estado sanitario de la ubre; por el desarrollo de microorganismos que desdoblan la lactosa en ácido láctico, entre otros factores. Según Negri (2005), valores de pH entre 6.9-7.5 son el resultado de leches mastíticas.
Cuando la leche presenta mucha acidez, se agrega un adulterante químico para disminuirla y así conseguir que la leche cumpla con el rango de acidez establecido, entre las sustancias químicas que se pueden añadir a la leche se encuentran: los peróxiodos, sal de sodio y cloro (Salazar, 2013).
14 aumenta en las leches mastíticas o con frecuencia se encuentra aumentado en leches que han sido adulteradas por adición de agua.
Según la norma técnica ecuatoriana para leche cruda NTE INEN 9:2015, esta posee un límite mínimo y máximo de acidez de 0.13 % a 0.17 %, ninguna de la empresas cumplen con este requisito (Tabla 1). Según Celis & Juárez (2009), indican que una acidez menor al 0.15 % se debería a la mastitis, al aguado de la leche o por la alteración ocasionada con algún producto alcalinizante.
Además en los resultados obtenidos se observa el crecimiento de E.coli en
las tres empresas de ASOPROLAM. La presencia de E.coli en la leche cruda
es un indicativo de una probable contaminación de origen fecal y el peligro de otras bacterias asociadas a las heces tanto de humanos o de animales (FAO,
2011). Las bacterias de E.coli son consideradas como un indicador
importante de higiene durante todo el proceso de obtención, almacenamiento, distribución y venta de leche cruda (Bogdanovičová, y otros, 2016).
De acuerdo con Bogdanovičová, y otros (2016), la norma CSN 57 0529: 1993 fija el valor límite de este indicador para leche cruda de vaca en 1.0x103 UFC/mL, los recuentos de E.coli en las muestras de leche de las tres empresas, se encuentran dentro del límite en comparación con la norma estipulada.
3.2 APLICACIÓN DEL SOFTWARE DE MICROBIOLOGÍA
PREDICTIVA APLICADA A LA ETAPA DE RECEPCIÓN
DE LECHE DE LA EMPRESA LÁCTEOS PUCATE
En la Figura 1 se muestra la cinética de crecimiento de la bacteria E.coli en
15 Figura 1. Curvas de creci mi ento determi nada s a través de mi crobiología experi mental y predi ctiva (Combase) en función de a) Temperatura b) pH c)
NaCl (%) y d) Log UFC/mL de la Empresa Lácteos Pucate
16 La población final es de 8.6 log UFC/mL en 8 horas alcanzando el mismo valor cuando el pH es 6.64 en un tiempo de 26 horas, en estos dos casos la velocidad de crecimiento es de 3.68 y 0.97 (gen/h), respectivamente.
En la curva generada a partir de datos experimentales perteneciente al crecimiento de E.coli a 19.50 ºC, se puede observar que la fase de latencia apenas se distingue, por lo cual se asume que el microorganismo se adapta rápidamente al medio e inicia inmediata y constantemente su fase exponencial.
Se puede observar un crecimiento lento en la curva de predicción que corresponde al crecimiento de E.coli a 10 ºC, observándose que a las 48 h
aún continúa en fase de latencia, con una población final de 4 logUFC/mL. La
duración de la fase de latencia se ve afectada por los cambios en el medio fisicoquímico, como la temperatura, el pH y aw, el historial térmico y la
disponibilidad de nutrientes, entre otros factores (Aguirre, 2013). De acuerdo con Madigan, Martinko & Parker (2003), a muy bajas temperaturas, las membranas gelifican y las enzimas no operan a gran velocidad, el transporte de nutrientes es tan lento que no hay crecimiento.
Al modificar la concentración de cloruros (Figura 1.c), se observa que la curva de crecimiento generada por el software de predicción a una concentración de 0.500 %NaCl presentó un aumento en la duración de su fase de latencia en relación a las demás curvas de crecimiento con concentraciones de 0.020 %NaCl y 0.193 %NaCl respectivamente, en donde la duración de sus fases de latencia es menor. Resultados similares han sido observados por Robinson, Ocio, Kaloti, & Bernard (1998), quienes investigaron la duración de
la fase de adaptación en Listeria monocytogenes en relación con las
propiedades fisicoquímicas del medio de crecimiento, en donde la fase de latencia aumentó a medida que aumentaba la concentración de NaCl, así también pequeños cambios en la osmolalidad por encima de 3.0 NaCl OsM produjeron aumentos muy grandes de la fase de latencia.
En la curva de crecimiento proyectada a una concentración de 0.500 %NaCl,
se observa que la población final de E.coli es de 8.62 logUFC/mL en un lapso
de 30 horas, en tanto que la curva de crecimiento generada a una
concentración de 0.193 %NaCl la población final es de 8.64 logUFC/mL en
un tiempo de 27 horas, mientras que la curva de predicción a 0.020 %NaCl se observa que la población final es de 8.65 logUFC/mL en un período de 24 horas. La alteración en la concentración de %NaCl afecta directamente a la capacidad del microorganismo para adaptarse al medio (Prescott, Harley, & Klein, 2004).
Los datos experimentales indicaron una población inicial de E.coli de 2.54 log
UFC/mL que alcanzaría una concentración final de 8.64 logUFC/mL luego de
17 crecimiento es de 0.97 gen/h. Estos parámetros varían cuando se utiliza una población inicial de 1 log UFC/mL alcanzando a las 32.4 horas (1.4 días) de su crecimiento una concentración final de 8.6 log UFC/mL, la velocidad de crecimiento es de 0.97 gen/h. Mientras que si la concentración inicial de la bacteria en la leche cruda es de 5 log UFC/mL alcanzaría una concentración
final de 8.66 logUFC/mL luego de 16.4 horas (0.7 días), con una reducción de
la velocidad de crecimiento a 0.96 gen/h.
3.3 APLICACIÓN DEL SOFTWARE DE MICROBIOLOGÍA
PREDICTIVA APLICADA A LA ETAPA DE RECEPCIÓN
DE LECHE DE LA EMPRESA LÁCTEOS ESTELITA
En la Figura 2 se muestra la cinética de crecimiento de la bacteria E.coli en
leche crudapara diferentes condiciones de crecimiento.
Figura 2. Curvas de crecimiento determinadas a través de microbiología experimental y predictiva (Combase) en función de a) Temperatura b) pH c) NaCl (%) y d) Log UFC/mL de
18 Se puede observar un comportamiento similar a los resultados encontrados en la leche cruda de la empresa Pucate, en cuanto a la evolución de la
población de E.coli al aumentar o disminuir la temperatura, el pH, % de NaCl
o con las diferentes condiciones iniciales.
En relación a la variación de las diferentes condiciones de crecimiento tanto de pH, % de NaCl y de condiciones iniciales (Figuras 1.b, 1.c, 1.d) y su efecto sobre el crecimiento del microorganismo se observa un comportamiento similar en cuanto a las poblaciones finales alrededor de las 25 horas. En tanto que a 37º C el microorganismo crece más rápido con el aumento de la temperatura, la población final es de 8.66 log UFC/mL en un tiempo de 8 horas.
3.4 APLICACIÓN DEL SOFTWARE DE MICROBIOLOGÍA
PREDICTIVA APLICADA A LA ETAPA DE RECEPCIÓN
DE LECHE DE LA EMPRESA LÁCTEOS ADRIANITA
En la Figura 3 se muestra la cinética de crecimiento de la bacteria E.coli en
19 Figura 3. Curvas de creci mi ento determi nadas a través de mi crobiología experi mental y predi ctiva (Combase) en función de a) Temperatura b) pH c)
NaCl (%) y d) Log UFC/mL de l a Empresa Lácteos Adrianita
Como se observa en la Figura 3, los resultados son muy semejantes a los obtenidos para la empresa Pucate y Estelita.
La norma CSN 57 0529: 1993 fija el valor límite de E.coli para leche cruda de
vaca en 1.0x103 UFC/mL (Log 3), utilizando el software de predicción bajo las
20
3.5
VELOCIDAD
DE
CRECIMIENTO
Y
TIEMPO
GENERACIONAL
Se aplicaron las ecuaciones 2 y 3 para obtener la velocidad de crecimiento (k)
y el tiempo generacional (g) del microorganismo, según se detalla en el literal 2.4. La Tabla 2 muestra el efecto de las diferentes condiciones (valor inicial del recuento, temperatura (ºC), pH y % NaCl) sobre estos dos parámetros de crecimiento.
Tabla 2. Cálculo de laVelocidad de Crecimiento y Tiempo generacional de E.coli
PUCATE ESTELITA ADRIANITA
k (gen/h) g (h/gen) k (gen/h) g (h/gen) k (gen/h) g (h/gen) Población inicial (UFC/mL)
5.00 0.96 1.04 1.08 0.93 1.58 0.63 2.00 - 2.60 0.97 1.03 1.10 0.91 1.60 0.62 1.00 0.97 1.03 1.10 0.91 1.60 0.63
Temperatura (°C)
37.00 3.68 0.27 3.69 0.27 3.65 0.27 19.00 - 23.00 0.97 1.03 1.10 0.91 1.61 0.62 10.00 0.12 8.03 0.12 8.09 0.13 7.95
pH
7.00 0.91 1.09 1.04 0.97 1.50 0.67 6.55 - 6.70 0.97 1.03 1.10 0.91 1.59 0.63 5.60 0.74 1.35 0.85 1.18 1.23 0.82
Cloruros (NaCl %)
0.50 0.84 1.19 0.96 1.05 1.37 0.73 0.19 - 0.30 0.96 1.04 1.09 0.92 1.59 0.63 0.02 1.10 0.91 1.26 0.80 1.84 0.54
Se puede observar en la Tabla 2 la relación proporcional entre estos dos parámetros de crecimiento, es decir, una mayor velocidad de crecimiento frente a un menor tiempo de generación. Resultados similares han sido observados por Dos Santos (2007), quién realizó un estudio del comportamiento cinético de microorganismos de interés en seguridad
alimentaria con modelos matemáticos, es así, que para Escherichia coli
CECT 516, se presentó una velocidad de crecimiento elevada (1.88 h-1), así
como un tiempo de generación bajo de (0.16 h), lo cual confirma la relación entre estos dos parámetros, una mayor velocidad de crecimiento versus menor tiempo de generación.
Conforme al estudio realizado la mejor combinación para predecir el
crecimiento de E.coli en cada una de las empresas fue 37 ºC, pH 6.64, 0.193
21 3.68 gen/h y tiempo de generación bajo de 0.27 (h) para la empresa Pucate. Para la empresa Estelita fue de 37 ºC, pH 6.55, 0.205 %NaCl y 2.00 log UFC/mL, con lo que se obtuvo una velocidad de crecimiento de 3.69 gen/h y tiempo generacional de 0.27 (h). Finalmente las condiciones para la empresa Adrianita fue de 37 ºC, pH 6.64, 0.199 %NaCl y 2.60 log UFC/mL con una velocidad de crecimiento y tiempo generacional de 3.65 gen/h, 0.27 (h), respectivamente. Por lo tanto bajo estas condiciones el microorganismo va a incumplir la norma lo más rápido posible, dado a la alta velocidad de crecimiento del microorganismo, por lo cual es importante controlar factores como la temperatura, pH y concentración de cloruros que influyen en el crecimiento de esta bacteria.
Determinar el tiempo de generación es importante, ya que, es el tiempo que tardan las células microbianas en duplicarse, y es útil como indicador del estado fisiológico de una población celular (Dos Santos, 2007), por lo tanto cualquier cambio del medio que prolongue el tiempo de generación extenderá el tiempo de conservación del alimento y una mayor vida útil del mismo.
Se puede observar también cómo a mayor población inicial (Log UFC/mL), la velocidad de crecimiento disminuye, por el contrario a una menor población inicial (Log UFC/mL), la velocidad de crecimiento aumenta.
Con respecto al parámetro de temperatura se puede observar en la Tabla 2, como a una mayor temperatura la velocidad de crecimiento aumenta. Esto se debe a que el metabolismo en general es más activo a temperaturas altas y el microorganismo crece más rápidamente con el aumento de temperatura, pero a partir de cierto punto un mayor aumento disminuye la velocidad de crecimiento, y temperaturas más altas llegan a ser letales dado que ocasionan daños a los microorganismos al desnaturalizar las enzimas, las proteínas transportadoras, y otras proteínas (Prescott, Harley, & Klein, 2004). Confirmando el efecto de la temperatura sobre la viabilidad y el crecimiento microbiano.
Con respecto al pH, se puede observar en la Tabla 2, una mayor velocidad de crecimiento con valores de pH comprendidos entre 6.55 – 6.70, por otra parte a un pH de 5.60 la velocidad de crecimiento es menor.
En cuanto a la concentración de cloruro de sodio, se evidenció como la velocidad de crecimiento disminuye con el incremento de la concentración de sal. Este comportamiento es similar al descrito por Robinson, Ocio, Kaloti, & Bernard (1998), en donde una osmolalidad aumentada, redujo la tasa de crecimiento. En tanto que a una baja concentración de cloruro de sodio, la velocidad de crecimiento aumenta.
23
4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
4.1 CONCLUSIONES
La leche de las tres empresas, se encuentran dentro del rango de pH óptimo de 6.5-6.65, en cuanto acidez no cumplen con este requisito, siendo el límite mínimo 0.13 % y el límite máximo 0.17 %, con respecto a la concentración de cloruros, sobrepasan el valor máximo permitido por la norma venezolana COVENIN 903-93 (0.11 %).
La población inicial de E.coli en las muestras de leche cruda
provenientes de las empresas Pucate, Estelita y Adrianita (2.54, 2.00, 2.60 log UFC/mL, respectivamente), se encuentran dentro del límite en
comparación con la norma CSN 57 0529: 1993 (1.0x103 UFC/mL).
Con la población de E.coli presente en las muestras de leche cruda de
las tres empresas se puede predecir el tiempo en el que alcanzaría el valor límite de E.coli (1.0x103 log UFC/mL) corresponde a 2.4 horas (0.1 días), 4 horas (0.2 días) y 1.4 horas (0.1 días) para las empresas Pucate, Estelita y Adrianita, respectivamente, constituyendo un riesgo para la calidad e inocuidad de los derivados que se procesen utilizando esta materia prima.
La velocidad de crecimiento y el tiempo de generación, pueden verse significativamente afectados principalmente por las condiciones ambientales (temperatura y composición del medio de cultivo), cuanto más favorables sean las condiciones, mayor será el crecimiento. La temperatura fue el factor que más condicionó el comportamiento cinético del microorganismo. A una mayor concentración de sal, la velocidad de crecimiento del microorganiso disminuyó.
24
4.2 RECOMENDACIONES
Se recomienda predecir el crecimiento de otros microorganismos con el uso de otros paquetes informáticos.
Correlacionar el crecimiento con el programa y con un estudio experimental in situ, para verificar que los datos que proporciona el programa son verídicos al ser comparados en condiciones reales.
25
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28
RECOLECCIÓN DE MUESTRAS EN LA ETAPA DE
RECEPCIÓN
Toma de muestra en la etapa de recepción
Toma de muestra en la etapa de recepción
Medición de pH y temperatura de la muestra
in situ
29
ANEXO 2
RECUENTO DE MICROORGANISMOS
Empresa 1 coliformes totales- E. coli
Empresa 2
coliformes totales- E. coli
