Los ensayos realizados para ambas variantes optimizadas habían demostrado que los dominios mantienen su actividad de manera independiente y eran estables tras incubaciones a tiempos largos a 37ºC. Por otro lado, los estudios de microscopía confocal mostraron que la adición de un sitio de corte para furina en el diseño de estas construcciones modificaba sensiblemente la localización intracelular de los inmunoconjugados durante su internación y procesamiento intracelular, observándose un incremento en la cantidad de RNasa presente en el citosol y consecuentemente una menor colocalización en los orgánulos de transporte o reciclaje, en comparación con lo observado con las inmunoRNasas originales.
Por ello, el siguiente paso fue el estudio de la actividad citotóxica de las variantes optimizadas, para comprobar si estos resultados tenían un reflejo en la eficacia citotóxica de estas variantes de furina frente a las originales, para así validar esta estrategia de optimización de su funcionalidad.
Se utilizaron distintos ensayos para evaluar la actividad citotóxica, en función de la especificidad del dominio tóxico. De esta forma, para la variante con α-sarcina se estudió la inhibición de la biosíntesis de proteína mediante un ensayo con leucina tritiada, como medida de muerte celular; mientras que para la variante con RNasa T1 se realizó el ensayo de viabilidad celular con MTT.
Además, para comprobar la repercusión sobre la eficacia citotóxica de las inmunoRNasas, del efecto observado tras la inclusión de diferentes inhibidores de las rutas intracelulares, se incluyeron ensayos con brefeldina-A (inhibidor de la ruta a través del aparato de Golgi) y bafilomicina (inhibidor de la ruta a través de lisosomas).
B1.5.1.- Ensayos de citotoxicidad en ausencia de inhibidores de las rutas intracelulares
Ensayo de inhibición de Leucina tritiada: IMTXA33furαS vs IMTXA33αS.
Como se ha comentado anteriormente, para el estudio de las inmunotoxinas basadas en la α-sarcina, se realizó el ensayo de inhibición de biosíntesis de proteínas como método para el estudio de su citotoxicidad. Este ensayo permite cuantificar la actividad de los ribosomas de las células tratadas mediante el suministro de leucina marcada con isótopo radioactivo, tras ser incubadas las células con la proteína estudiada durante el tiempo establecido (Lacadena et al., 1999; Olmo et al., 2001).
El ensayo se llevó a cabo, según lo descrito en el correspondiente apartado de Métodos. Los resultados (Figura B22) mostraron una elevada eficacia citotóxica de la variante optimizada frente a las células SW1222, con un valor de IC50 de 15 nM, significativamente inferior a la de IMTXA33αS, que se encuentra alrededor de 30 nM. Por tanto, la variante IMTXA33furαS presenta un incremento de su eficacia citotóxica respecto a la construcción original.
Estos resultados, son coherentes con lo observado en los estudios de tráfico intracelular. De este modo, la optimización en la liberación de la α-sarcina al citosol en la IMTXA33furαS por acción de la furina, tanto en los endosomas como en el aparato de Golgi, incrementa la cantidad de toxina efectiva para producir la inactivación del ribosoma, lo que se traduce en un incremento significativo de su eficacia citotóxica sobre las células diana.
Ensayo de viabilidad celular: scFvA33furT1 vs scFvA33T1.
Para el estudio de la citotoxicidad de scFvA33furT1, al igual que con su variante original, se llevó a cabo un ensayo clásico de viabilidad celular basado en el MTT como método para determinar la citotoxicidad de esta construcción, mediante la incubación de las células SW1222 con la inmunoRNasa, tal y como se especifica en Métodos. Del mismo modo que con scFvA33T1, se alargaron los tiempos de incubación hasta 96 horas para observar mejor los efectos del tratamiento.
Figura B22. Ensayo de citotoxicidad de la IMTXA33αS y IMTXA33furαS con células SW1222. Las gráficas muestran los resultados tras 72 horas de incubación. La línea discontinua representa la inhibición del 50% (IC50) de la
biosíntesis de proteínas, medida de la viabilidad específica para la actividad de las ribotoxinas.
Los resultados mostrados en la Figura B23, comparando la versión optimizada con su original, confirmaron un aumento muy significativo de la citotoxicidad de la variante scFvA33furT1, con un valor de IC50, alrededor de 300 nM. Sin embargo, este valor sigue siendo mayor que el observado con la variante de αS, confirmando lo observado en los estudios de trafficking. Así, a pesar de la disminución en la colocalización a tiempos largos en Golgi y en lisosomas en la variante optimizada scFvA33furT1, la mayor liberación al citosol de la α-sarcina y su actividad ribonucleolítica específica la confieren una mayor eficacia citotóxica.
B1.5.2.- Ensayos de citotoxicidad en presencia de inhibidores de las rutas intracelulares
Si bien se ha observado que ambas variantes optimizadas mejoran la citotoxicidad de las inmunoRNasas originales, en el caso de la variante scFvA33furT1 no se logró la eficacia esperada. Considerando la hipótesis de que este hecho esté relacionado con los resultados obtenidos en los estudios de trafficking, se quiso profundizar más en el estudio de las distintas rutas intracelulares que siguen los distintos inmunoconjugados. Por ello, se llevaron a cabo ensayos de citotoxicidad en presencia de los inhibidores específicos mencionados anteriormente, brefeldina-A y bafilomicina.
Figura B23. Ensayo de viabilidad celular mediante MTT de la scFvA33T1 y scFvA33furT1 con células SW1222. Las gráficas muestran los resultados tras 96h de incubación. La línea discontinua representa el 50% (IC50) de la
viabilidad del cultivo.
B1.5.2.1.- Ensayos de viabilidad celular con inhibidores
Para determinar la concentración óptima del inhibidor, evitando toxicidades inespecíficas elevadas atribuibles a su propio efecto inhibidor, se ensayaron distintas concentraciones de los mismos en las condiciones descritas para los ensayos de citotoxicidad.
Los resultados mostraron que la brefeldina A tenía una alta letalidad por encima de 1.10-3 μg/mL, mientras que para la Bafilomicina A el rango de acción está comprendido entre 10- 3 y 10-4 μg/mL (Figura B24). De acuerdo con lo descrito para este tipo de ensayos, la concentración de inhibidor que se suele utilizar corresponde con intervalor de muerte celular entre el 10 y 20%. En nuestro caso, corresponde con 1 ng/mL para la Brefeldina A y entre 1 y 5 ng/mL de Bafilomicina, fijándola ne los futuros ensayos en 1 ng/ml para la Brefeldina A y 5 ng/mL para la Bafilomicina.
B1.5.2.2.- Estudio del efecto de los inhibidores sobre la eficacia citotóxica de IMTXA33furαS vs IMTXA33αS
Estudios previos habían demostrado la elevada eficacia citotóxica de la IMTXA33αS frente a células GPA33 positivas, con un IC50 alrededor de 30 nM (Carreras-Sangrà et al., 2012). En este caso, se repitieron los ensayos de incorporación de leucina tritiada (H3-Leu) en presencie del inhibidor del aparato de Golgi (Brefeldina A, 1 ng/ml) y del inhibidor de la acidificación de los lisosomas (Bafilomicina A1, 5 ng/ml), en las mismas condiciones que
Figura B24. Ensayo de
viabilidad de los inhbidores de rutas intracelulares mediante MTT frente a células SW1222. Las gráficas muestran los resultados tras 72 horas de incubación con distintas concentraciones de Brefeldina (círculos grises) y Bafilomicina (círculos blancos). La línea discontínua marca el 20% de muerte celular.
los ensayos originales. En la Figura B25, una vez normalizados los resultados frente a los controles con el inhibidor, se muestra los resultados obtenidos. Se observó que la adición de bafilomicina no implica diferencias en la citotoxicidad ejercida por la inmunotoxina, mientras que la inclusión de Brefeldina aumentó de forma significativa el valor de IC50, hasta un valor superior a los 500 nM, disminuyendo drásticamente su eficacia citotóxica.
El efecto producido por los inhibidores sobre la citotoxicidad de IMTXA33αS es coherente con lo observado en los estudios de trafficking. La Bafilomicina no modificaría los parámetros de la inmunotoxina ya que la presencia en lisosomas de la misma es prácticamente residual. En cambio, la inhibición del tráfico intracelular a través del aparato de Golgi reduce drásticamente su actividad tóxica, ya que supone un obstáculo para la liberación de la toxina en el citosol.
Con la finalidad de comparar este efecto sobre la variante optimizada de furina, se repitieron los ensayos en presencia de los inhibidores de Golgi y lisosomas manteniendo las condiciones anteriormente utilizadas. Nuevamente, la presencia de Bafilomicina no supuso ningún efecto respecto a la citotxocidad exhibida por la IMTXA33furαS sola (Figura B26). Sin embargo, el resultado obtenido en presencia de brefeldina-A, produce un efecto contrario a lo observado con la IMTXA33αs. La eficacia citotóxica de IMTXA33furαS aumentó en presencia del inhibidor de Golgi, con un valor de IC50 de 5 nM, tres veces menor que el obtenido con la inmunotoxina sin inhibidor (Tabla B11). Este resultado aparentemente contradictorio se explicaría por la presencia del sitio de corte de furina, que
Figura B25. Ensayo de Viabilidad
celular mediante la incorporación de H3-Leu de la IMTXA33αS frente
a células SW1222. Las gráficas muestran los resultados tras 72 horas de incubación con distintas concentraciones de IMTXA33αS sola (cuadrados negros), en presencia de Brefeldina A (cuadrados blancos) y en presencia de Bafilomicina (cuadrados grises). La línea discontinua representa la inhibición del 50% (IC50) de la biosíntesis de
proteínas, medida de la viabilidad específica para la actividad de las ribotoxinas.
capacidad de la α-sarcina para interaccionar con sus membranas ricas en fosfolípidos ácidos, traslocándose al citosol, incluso aunque se vea inhibido el transporte vesicular del aparato de Golgi.
Estos resultados suponen una confirmación de la relación entre el procesamiento intracelular delas inmunotoxinas y su eficacia citotóxica. Además, se ha demostrado que la adición de un sitio de corte reconocido por la proteasa furina mejora la eficacia citotóxica de la construcción original, siendo un ejemplo de optimización en el desarrollo de inmunotoxinas.
B1.5.2.3.- Estudio del efecto de los inhibidores sobre la eficacia citotóxica de scFvA33furT1 y scFvA33T1
Los estudios previos realizados con scFvA33T1 mostraron su acumulación en lisosomas y aparato de Golgi, justificando su menor eficacia citotóxica en comparación con las
Tabla B11. Datos de IC50de las inmunotoxinas basadas en α-sarcina, en presencia o
no de los distintos inhibidores de las rutas intracelulares.
Figura B26. Ensayo de Viabilidad
celular mediante la incorporación de H3-Leu de la IMTXA33furαS frente a
células SW1222. Las gráficas
muestran los resultados tras 72 horas de incubación con distintas concentraciones de IMTXA33furαS sola (rombos negros), en presencia de Brefeldina A (rombos blancos) y en presencia de Bafilomicina (rombos grises). La línea discontinua representa la inhibición del 50% (IC50)
de la biosíntesis de proteínas, medida de la viabilidad específica para la actividad de las ribotoxinas.
inmunotoxinas basadas en la α-sarcina. Para profundizar en este mecanismo se realizaron realizar ensayos de viabilidad cdelular por MTT en presencia de los inhibidores anteriormente citados.
En la Figura B27 se observa que, si bien la inhibición del transporte vesicular a través del aparato de Golgi con Brefeldina no provocó variaciones significativas en la eficacia citotóxica, la presencia de Bafilomicina y la consecuente inactivación de los lisosomas, supuso una disminución de la viabilidad celular hasta alcanzar una IC50 entre 70 y 90 nM. Este aumento de la eficacia citotóxica estaría relacionado con la inhibición de la degradación del inmunoconjugado en los lisosomas, permitiendo que a tiempos largos se produzca la liberación de RNasa T1 al citosol. En este sentido, la inhibición del aparato de Golgi no afecta a la citotoxicidad de la construcción original ya que no se ve inhibida la vía lisosomal.
Finalmente, se repitieron estos ensayos en presencia de inhibidores con la variante scFvA33furT1, para estudiar el efecto sobre su eficacia citotóxica. En la Figura B28 se muestran los resultados obtenidos. Como se observa, no se encontraron diferencias cuando se inhibió el transporte vesicular del aparato de Golgi por adición de brefeldina-A. Sin embargo, con la inhibición de la acidificación de los lisosomas, se observó un descenso muy significativo de la viabilidad celular, obteniéndose valores de IC50 alrededor de 80 nM. Si comparamos estos resultados con los obtenidos con la construcción original, los resultados mostraron que la brefeldina-A no tiene efecto sobre la actividad citotóxica,
Figura B27. Ensayo de Viabilidad celular mediante MTT de la scFvA33T1 frente a células SW1222. Las gráficas muestran los resultados tras 96 horas de incubación con distintas concentraciones de scFvA33T1 sola (Triángulos negros), en presencia de Brefeldina A (Triángulos blancos) y en presencia de Bafilomicina (cuadrados grises).
mientras que ambos caso sí se observó un descenso en la viabilidad celular en presencia de bafilomicina, dando como resultado una IC50 alrededor de 70-90 nM.
En la Tabla B12 se muestra una comparación de los valores de IC50 entre ambas construcciones en ausencia o presencia de los inhibidores. Aunque se observa una mejora en la eficacia para la scFvA33furT1 en presencia de Bafilomicina, sin embargo, este descenso en la viabilidad no mejora al obtenido con la construcción original, también en presencia de este inhibidor. Este hecho sugeriría que, una vez inhibida la degradación a través de lisosomas, la dificultad para interaccionar con membranas, así como la actividad RNasa inespecífica de la RNasa T1, tienen mayor efecto sobre la eficacia citotóxica que la liberación de la RNasa T1 del dominio marcador.
Figura B28. Ensayo de Viabilidad celular mediante MTT de la scFvA33furT1 frente a células SW1222. Las gráficas muestran los resultados tras 96 horas de incubación con distintas concentraciones de scFvA33furT1 sola (Triángulos negros), scFvA33furT1 en presencia de Brefeldina A (Triángulos blancos) y scFvA33furT1 en presencia de Bafilomicina (cuadrados grises). La línea discontinua representa el 50% (IC50) de la viabilidad del
cultivo.
Tabla B12. Datos de IC50 de las inmunoRNasas basadas en T1, en presencia o no de