Como parte del trabajo de nuestro grupo investigación, se han producido, purificado y estudiado en profundidad dos inmunoRNasas: la IMTXA33αS y la scFvA33T1, basadas en la ribotoxina α-sarcina y en la RNasa no tóxica T1, respectivamente. Ambos inmunocomplejos están unidos mediante un linker proteico a los dominios variables del anticuerpo monoclonal humanizado A33 (scFvA33), que actúa como dominio marcador y les dirige al antígeno GPA33, Ambas inmunoRNasas han sido estudiadas en detalle, mediante su caracterización estructural y funcional. Además, han servido como modelos para la comparación del efecto de distintos dominios tóxicos y la relación entre el tráfico intracelular y la citotoxicidad de las construcciones (Tomé-Amat et al., 2015a; Tomé-Amat et al., 2015c).
Las diferencias en la actividad antitumoral observada en estos estudios entre ambas pueden ser explicadas por dos razones: La exquisita especifidad de la actividad ribonucleasa de la α-sarcina frente a los ribosomas (Lacadena et al., 2007; Carreras- Sangrà et al., 2012), en comparación con la diana intracelular inespecífica de la RNasa T1 (Yoshida, 2001; Tomé-Amat et al., 2012) y la ruta de internación seguida por cada dominio tóxico, siendo ésta determinante para la citotoxicidad (Tomé-Amat et al., 2015a). Así, la RNasa T1 es una RNasa inespecífica, con preferencia por la hidrólisis de enlace ricos en Guanina (GpN), que, aunque tiene el mismo mecanismo catalítico que las ribotoxinas, sin embaego carece de las características estructurales necesarias para interaccionar con los ribosomas. Por otro lado, la presencia de los lazos de estructura no ordenada y su carácter básico en la α-sarcina le permiten traslocarse al citosol desde el interior de los endosomas o desde las vesículas de transporte de la ruta retrógrada del aparato de Golgi, debido a su capacidad para intraccionar con membranas ricas en fosfolípidos ácidos, como son las de estos orgánulos. Sin embargo, el carácter ácido de la RNasa T1 le impide interaccionar con
2015a). Por ello, su liberación al citosol está impedida, provocando que se acumulen en el aparato de Golgi para finalmente ser derivados a los lisosomas, donde es parcialmente degradada (Figura I19).
Una vez comprobada la eficacia y especificidad citotóxica de las inmunotoxinas en ensayos in vitro con cultivos celulares, el siguiente paso fue la caracterización de la citotoxicidad in vivo. Los resultados previos con la inmunotoxina basada en α-sarcina, muestran que esta ribotoxina es la más prometedora de su clase para formar parte del diseño de nuevas terapias antitumorales (Carreras-Sangrà et al., 2012; Tomé-Amat et al., 2015a, 2015c; Jones et al., 2016). En este proceso, está establecido la utilización de modelos animales en las primeras etapas de esta caracterización, destacando entre ellos el empleo de ratones atímicos xenoinjertados (nude xenograft). Una vez generado un tumor localizado localmente en el ratón, se procede al estudio del efecto del tratamiento sobre el tumor inoculado y sobre el huésped. Los resultados preliminares mostraron resultados prometedores del tratamiento inoculado por vía intraperitoneal, reduciendo la velocidad de
Figura I19. Representación esquemática dela ruta intracelular seguida por la IMTXAA33αs y scFvA33T1.
Como se ha descrito previamente, la IMTXA33αS es internalizada vía endosomas siguiendo la ruta de transporte retrógrado del Aparato de Golgi, durante la cual la α-sarcina escapa al citosol donde ejerce su actividad ribotóxica. Por otro lado, la ScFvA33T1 una vez internalizada se acumula tanto en el Aparato de Golgi como en los Lisosomas. El diferente mecanismo de liberación es el principal motivo para que la IMTXA33αS muestre una mayor citotoxicidad. Adaptado de Tomé-Amat et al., 2015a.
crecimiento tumoral con respecto al grupo control, y no mostrando ningún efecto secundario, en comparación con el grupo tratado con la α-sarcina sola, que presentó daños claros a nivel epidérmico y limitación de su capacidad motora (Tomé-Amat et al., 2015c). Los pasos a seguir consisten en seguir profundizando sobre los efectos a nivel de expresión antigénica, así como estudiar si la eficacia del tratamiento se mantiene al inocular la inmunotoxina por vía intravenosa. Finalmente, en nuestro grupo de investigación se han desarrollado otras inmunotoxinas, que mantienen como dominio tóxico la ribotoxina α- sarcina, pero cuyo dominio marcador está dirigido a células que presenten el antígeno de carcinoma embrionario (CEA), sustituyendo el dominio marcador anti GPA33 de la IMTXA33αS por el MFE-23, obteniéndose la inmunotoxina IMTXCEAαS, con diferentes formatos estructurales. Los resultados obtenidos con estas nuevas han demostrado su prometedor potencial como agentes antitumorales (Lázaro-Gorines et al., 2019).
Todas las construcciones que se han desarrollado en nuestro grupo han sido producidas en el sistema de expresión heterólogo Pichia Pastoris, descrito como organismo seguro para la salud (GRAS, Generally Regarded as Safe) (Mattia & Merker, 2008; Tran et al., 2017) (Figura I20). En este sistema, las inmunotoxinas son producidas como proteínas de fusión asociadas al péptido señal del factor α, y secretadas al medio extracelular en su forma madura tras la digestión por proteasas de la familia Kex2. La eficiencia y fiabilidad de P. pastoris está demostrada
ampliamente, ya que ha sido utilizado con éxito en la producción de distintos tipos de inmunocomplejos e inmunotoxinas (Cuesta et al., 2009; Damasceno et al., 2009; Carreras-Sangrà et al., 2012; Tomé-Amat et al., 2012, 2015a, 2015b, Blanco-Toribio et al., 2013, 2014; Lázaro-Gorines et al., 2019).
Figura I20. Imagen de la levadura metilotrófica
Pichia Pastoris. Foto: Dennis Kunkel
Los trabajos realizados en nuestro grupo de investigación en el campo del diseño y caracterización de inmunotoxinas antitumorales, ha permitido confirmar el potencial terapéutico de las inmunotoxinas basadas en ribonucleasas fúngicas. A partir de estos resultados previos, recogidos en diferentes publicaciones y tesis doctorales, el objetivo general de este trabajo se centra en la caracterización exhaustiva de su efecto antitumoral
in vivo, junto con el diseño de nuevas variantes optimizadas en sus propiedades
funcionales que impliquen un incremento de su eficacia.
Este objetivo general, puede concretarse en los siguientes objetivos específicos, agrupados en dos bloques:
Bloque A: Estudio de la eficacia antitumoral in vivo de la inmunotoxina IMTXA33αS frente a células GPA33 positivas.
Este primer bloque supone la continuación del trabajo previo realizado con dicha inmunotoxina. Para ello, se va a estudiar el efecto de distintas vías de administración (intraperitoneal e intravenoso), así como el efecto de un tratamiento combinando con la inmunotoxina IMTXCEAαS, obtenida también en el grupo de investigación, incluyendo la caracterización antigénica exhaustiva de los tumores tratados.
Bloque B: Producción y caracterización de variantes optimizadas de inmunoRNasas. Para ello se van a seguir dos estrategias diferentes en su diseño:
1. Generación y caracterización de variantes optimizadas sensibles a furina a partir de dos inmunoRNasas previamente descritas, la IMTXA33αS y la scFvA33T1, con el fin de mejorar la liberación intracelular del dominio tóxico.
2. Estudio del efecto de la trimerización de inmunotoxina monomérica IMTXA33αS, mediante la plataforma trimerbody, sobre sus propiedades citotóxicas in vitro y antitumorales in vivo.