b Modificación del cuarzo

La espectroscopia UV-Vis se implementó para evaluar la intercalación de PMZ en el DNA. Los experimentos se llevaron a cabo en una celda de cuarzo de 0,1 cm de paso óptico. Para el estudio de la interacción de PMZ-dsDNA y PMZ-ssDNA en solución se mezcló una solución de PMZ con soluciones de dsDNA y ssDNA 100 ppm preparadas en buffer acetato 0,200 M pH 5,00. En el caso de la interacción entre PMZ y la dispersión se requirió de un paso previo de inmovilización de BCNT-dsDNA. Para ello se activó el cuarzo de acuerdo al procedimiento indicado en la sección 2.10.1 y luego se ensambló una solución de quitosano cuaternario 0,50 mg mL-1 _{con el fin de revertir las cargas} negativas de los grupos silicato del cuarzo activado. A continuación, se ensambló durante 60 min la dispersión BCNT-dsDNA sobre el cuarzo derivatizado positivamente con el quitosano. En todos los casos, los espectros UV-Vis se tomaron luego de 5 min de interacción (para emular las condiciones de stripping de adsorción por DPV), entre 200 y 600 nm.

4.2.2. Computacional

El modelado molecular es una herramienta poderosa para analizar las interacciones de sistemas biomoleculares, como las de los ácidos nucleicos con otros compuestos. El tratamiento de estos sistemas complejos requiere del uso de métodos de mecánica molecular, los cuales presentan bajo costo computacional y buena precisión. Sin embargo, en estos métodos la descripción de la estructura electrónica de estas macromoléculas se considera constante a lo largo de la simulación y es imposible

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describir las propiedades ópticas o los procesos de transferencia de carga. Para ello, es necesario utilizar métodos basados en la química cuántica.

A pesar de lo anterior, el estudio de la intercalación de ciertos compuestos con dsDNA a nivel atomístico es una tarea difícil de abordar para la química cuántica, ya que es necesaria una descripción exacta de las interacciones intermoleculares débiles, como los puentes de hidrógeno y el stacking de los pares de bases en la doble hebra. En las últimas décadas, la teoría del funcional de la densidad (DFT) ha sido una de las herramientas más usadas para representar la estructura electrónica de una amplia variedad de sistemas moleculares dada la exactitud de estos cálculos en comparación con los métodos ab-initio, de mayor costo computacional. Sin embargo, la DFT tiene algunos inconvenientes ya que su formalismo no describe correctamente las fuerzas de dispersión de London, responsables del “stacking” de las bases en el DNA. Si bien esta deficiencia puede ser superada fácilmente mediante la introducción de un término empírico correctivo (DFT-D), la convergencia de las energías de interacción es bastante lenta y es necesario utilizar un conjunto de base grande que a su vez limita significativamente el tamaño del sistema. En el presente trabajo de Tesis, y con el objetivo de describir la intercalación de PMZ en un oligómero de dsDNA, se utilizó un enfoque alternativo denominado Self Consistent Charges Density Functional Tight- Binding con corrección empírica para las energías de dispersión (SCC-DFTB-D) [26].

El método SCC-DFTB se basa en la expansión de segundo orden del funcional de energía de Kohn-Sham, respecto a la densidad electrónica de referencia de los átomos neutros [27]. Los elementos de la matriz Hamiltoniana se obtienen según la ecuación 4.4, 𝐻𝜇𝜈 = ⟨𝜑𝜇|𝐻̂0|𝜑𝜈⟩ + 1 2 𝑆𝜇𝜈 ∑(𝛾𝑖𝑘+ 𝛾𝑗𝑘) 𝑘 Δq𝑘 Ecuación 4.4.

donde 𝜑𝜇 y 𝜑𝜈 representan los orbitales atómicos de las especies i y j, respectivamente;

⟨𝜑𝜇|𝐻̂0|𝜑𝜈⟩ son los elementos de matriz del Hamiltoniano no SCC-DFTB dentro de la

parametrización de Slater-Koster. El término 𝑆𝜇𝜈= ⟨𝜑𝜇|𝜑𝜈⟩ es la matriz de solapamiento

y Δq𝑘 = 𝑞𝑘− 𝑞𝑘0 es la diferencia entre la carga del átomo aislado 𝑞𝑘0 y la carga 𝑞𝑘 cuando

el átomo k está formando parte del sistema, obtenida mediante el análisis de poblaciones de Mulliken.  es una función que depende de la separación interatómica, donde la contribución de las interacciones de los electrones se tiene en cuenta implícitamente. Por otro lado, se agrega un término suplementario a la energía electrónica (ecuación 4.5) que da cuenta de las fuerzas de dispersión:

𝐸 = 𝐸𝐷𝐹𝑇𝐵− ∑ 𝑓(𝑅𝑖𝑗) 𝑖𝑗

𝐶𝑖𝑗

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donde 𝑓(𝑅𝑖𝑗) es una función de amortiguación que permite obtener un balance entre

las fuerzas atractivas y repulsivas de corto alcance, 𝐶𝑖𝑗 son coeficientes empíricos que

dependen de las polarizabilidades atómicas y 𝑅𝑖𝑗 es la distancia entre los átomos i y j.

Se utilizó el código DFTB+ [28] para la optimización de las geometrías moleculares, el cálculo de la matriz Hamiltoniana y de solapamiento en la base de orbitales atómicos de Slater, y la matriz inicial de densidad de un solo electrón en la base de orbitales moleculares. Para los cálculos realizados en el presente trabajo de tesis se utilizó el conjunto de parámetros mio-1-1 para los elementos H, O, N, C, P y S

[27,29,30].

Este método se extiende al SCC-DFTB dependiente del tiempo (TD-DFTB) con el objetivo de obtener las propiedades de los estados excitados del sistema [31–33]. Se han propuesto diversas estrategias para la implementación de la TD-DFTB utilizando tanto la teoría de respuesta lineal como dinámicas electrónicas no lineales. En el presente trabajo se efectuó la propagación de la matriz densidad de un solo electrón en lugar de la función de onda de las partículas. Este método fue implementado exitosamente para calcular los espectros de absorción de pigmentos fotosintéticos [31,34] y de moléculas orgánicas adsorbidas sobre nanopartículas de TiO2[35]. Los mismos demostraron que los espectros de absorción basados en la TD-DFTB presentan mejor correlación con los experimentales que aquellos calculados a través de la TD-DFT.

Para calcular el espectro de absorción de PMZ y dsDNA se debe aplicar una perturbación al sistema y registrar la evolución temporal de la matriz densidad monoelectrónica. Esta perturbación consiste en una delta de Dirac aplicada a la matriz de densidad inicial del estado basal. Después de la aplicación del pulso, la misma evoluciona en el tiempo y dicha evolución puede ser calculada integrando la ecuación de Liouville-von Neumann (ecuación 4.6) en función del tiempo:

𝜕𝜌̂ 𝜕𝑡 = [𝑆

−1 _{𝐻̂ [𝜌] 𝜌̂ − 𝐻̂ [𝜌] 𝜌̂ 𝑆}−1_{] Ecuación 4.6.}

donde 𝜌̂ es la matriz de densidad de un solo electrón, S es la matriz de solapamiento y

𝐻̂ es el Hamiltoniano de SCC-DFTB. Cuando el campo eléctrico aplicado es pequeño, el sistema responde linealmente, y el momento dipolar viene dado por la ecuación 4.7:

𝜇(𝑡) = ∫ 𝛼(𝑡 − 𝜏) 𝐸(𝜏) 𝑑𝜏 Ecuación 4.7.

donde 𝛼(𝑡 − 𝜏) es la polarizabilidad a lo largo del eje donde se aplica el campo eléctrico

externo 𝐸(𝜏). El espectro de absorción del sistema es proporcional a la parte imaginaria de la polarizabilidad dependiente de la frecuencia  (ecuación 4.8), obtenida a partir de

100

la transformada de Fourier del momento dipolar dependiente del tiempo y luego de la deconvolución con el campo eléctrico aplicado.

𝛼(𝜔) = 𝜇(𝜔)

𝐸(𝜔) Ecuación 4.8.

Los cálculos de los espectros de absorción fueron realizados por la Dra. M. Belén Oviedo, del grupo del Prof. Dr. Cristián Gabriel Sánchez, en un trabajo en colaboración. En las simulaciones de dinámica cuántica se utilizó un octámero de dsDNA cuya secuencia fue 5’-d[CCTCGTCC]-3’. El sitio de intercalación se localiza entre el cuarto y quinto par de bases. La estructura minimizada de partida fue obtenida de la Protein Data Bank a partir de la secuencia intercalada por daunomicina, luego de lo cual esta molécula fue removida y reemplazada por PMZ. La figura 4.4 muestra la estructura del octámero con y sin la PMZ intercalada.

A

B

Figura 4.4. Estructuras optimizadas del oligonuclétido 5’-d[CCTCGTCC]-3’ (A) y del oligonucleótido con la PMZ intercalada entre el cuarto y quinto pb (B). Cian: C; rojo: O; blanco: H; azul: N; naranja: P; amarillo: PMZ.