Biosensor de afinidad para la cuantificación
4.3.1. Comportamiento electroquímico de PMZ
La figura 4.5 muestra los voltamperogramas cíclicos obtenidos sobre GCE (—) y GCE modificado con BCNT (—), BCNT-dsDNA (—) y BCNT-ssDNA (—) en solución de PMZ 1,00 x10-4 M preparada en buffer acetato 0,200 M pH 5,00. El perfil voltamperométrico
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de PMZ sobre GCE (mostrado en más detalle en el inset) exhibe, en el barrido directo, dos procesos anódicos, el primero a (0,638 ± 0,002) y el segundo a (0,81 ± 0,01) V, asociados a la escisión irreversible de la cadena lateral y a la formación del radical-catión fenotiazinio (ecuación 4.1) [16].
Figura 4.5. Voltamperogramas cíclicos obtenidos sobre GCE (—) y GCE modificado con BCNT (—), BCNT-dsDNA (—) y BCNT-ssDNA (—) en solución de PMZ 1,00 x10-4 M. Electrolito soporte:
buffer acetato 0,200 M pH 5,00. v = 0,010 V s-1. Inset: ampliación del voltamperograma cíclico
sobre GCE.
En el barrido inverso de potencial aparecen dos picos catódicos, uno a (0,386 ± 0,003) V y otro a (0,038 ± 0,004) V, asociados a los procesos reversibles del radical-catión fenotiazinio (ecuaciones 4.2 y 4.3) [16]. Experimentos de VC realizados revirtiendo el barrido a 0,700 V no modificaron la aparición de los procesos catódicos lo que indica que estos procesos de reducción sólo dependen del producto de oxidación de la PMZ generado a 0,638 V.
Sobre GCE/BCNT (figura 4.5, trazo rojo) se observa una disminución en el sobrepotencial del primer proceso de oxidación respecto a GCE ((0,58 ± 0,06) vs. (0,638 ± 0,002) V) y también un incremento de 4,1 veces en la densidad de corriente asociada. Esto se debe a las propiedades electrocatalíticas de los BCNT, ya discutidas en el capítulo anterior (sección 3.3.2). El perfil voltamperométrico de PMZ sobre GCE/BCNT-dsDNA (figura 4.5, trazo azul) muestra un incremento aún mayor en la densidad de corriente (19,7 y 4,9 veces más grande que sobre GCE y GCE/BCNT, respectivamente) indicando que hay una transferencia de carga facilitada y/o una mayor acumulación de la molécula sobre la superficie del electrodo modificado. Para estudiar el efecto de la presencia del dsDNA en la respuesta electroquímica de PMZ, se evaluó su respuesta sobre GCE
0,000 0,400 0,800 -0,30 0,00 0,30 0,60
j
/m
A c
m
-2E/V
0,000 0,400 0,800 0,00 0,02102
modificado con una dispersión de BCNT con ssDNA (figura 4.5, trazo verde). Se puede observar en el perfil j-E un pico de corriente ancho que involucra varios procesos anódicos, con densidades de corriente mayores que las obtenidas sobre GCE/BCNT pero mucho menores que las alcanzadas sobre GCE/BCNT-dsDNA. Estos múltiples procesos electroquímicos se pueden atribuir a la reacción del radical catión fenotiazinio con las bases libres del ssDNA que dispersa a BCNT, ya que dicho radical presenta alta tendencia a reaccionar con las bases nitrogenadas desapareadas [17].
Con el objetivo de dilucidar el mecanismo de transferencia de carga de PMZ sobre las distintas plataformas, se estudió el efecto de la velocidad de barrido de potencial sobre la respuesta de voltamperometría cíclica.
Figura 4.6. A Voltamperogramas cíclicos obtenidos sobre GCE/BCNT en solución de PMZ 1,00 x10-4 M a distintas velocidades de barrido: 0,002; 0,010; 0,025; 0,050; 0,100; 0,200 y 0,400 Vs-1.
B Variación del ancho de medio pico (Ep 1/2) con v para el primer proceso anódico de PMZ
sobre GCE/BCNT. La línea roja muestra el valor de Ep 1/2 para la oxidación irreversible
controlada por adsorción. C Voltamperogramas cíclicos obtenidos sobre GCE/BCNT-dsDNA en solución de PMZ 1,00 x10-4 M a distintas velocidades de barrido: 0,002; 0,010; 0,025; 0,050;
0,100; 0,200 y 0,400 V s-1. D Variación del potencial de oxidación (Ep) con v para el primer
proceso anódico de PMZ sobre GCE/BCNT-dsDNA. La línea roja muestra el ajuste según un mecanismo de difusión en capa delgada. Los voltamperogramas A y C fueron normalizados por v½ para mejor visualización. Electrolito soporte: buffer acetato 0,200 M pH 5,00.
0,000 0,400 0,800 -0,5 0,0 0,5 1,0 i -1/ 2 /m A V -1/ 2 s 1/ 2 E/V
A
0,001 0,010 0,100 50 60 70 80B
E p 1/ 2 /m V v/V s-1 0,000 0,300 0,600 0,900 -0,3 0,0 0,3 0,6C
i v -1/ 2 / A V -1/ 2 s 1/ 2 E/V -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,60 0,63 0,66 0,69 0,72D
E p /V log (v/V s-1)103
Dado que los fenómenos de transferencia de masa y carga son altamente dependientes de la escala de tiempo utilizada en voltamperometría (sección 2.1), variando este parámetro y analizando los cambios en los perfiles i-E se obtiene información mecanística de la reacción. En la figura 4.6 A se muestran los perfiles voltamperométricos (normalizados por v 1/2) sobre GCE/BCNT obtenidos en una
solución de PMZ 1,00 x10-4 M a distintas v. En la figura 4.6 B se grafica la dependencia del ancho de medio pico (Ep 1/2) con v para el primer proceso anódico de PMZ. Para cualquier velocidad se observa que Ep 1/2 es constante y aproximadamente igual a 62,5 mV, lo cual se ajusta a un mecanismo de oxidación irreversible controlado por adsorción (sección 2.1.2).
De la misma manera, se estudió el proceso de transferencia de carga sobre GE/BCNT-dsDNA. En la figura 4.6 C se presentan los perfiles voltamperométricos (normalizados por v 1/2) de PMZ 1,00 x10-4 M sobre GCE/BCNT-dsDNA a distintas v. La dependencia del potencial del primer pico anódico de PMZ con log v (figura 4.6 D) corresponde al comportamiento de una cupla redox controlado por difusión en capa fina (sección 2.1.3). Estos resultados indican que PMZ interactúa fuertemente con la película de dsDNA que se encuentra dispersando a BCNT más que con éstos últimos. El comportamiento redox observado es similar al encontrado en otras moléculas electroactivas confinadas en una película delgada de polímero [36,37].
En el caso de GCE/BCNT-ssDNA, no fue posible obtener Ep con un grado de certeza razonable para todas las v medidas debido a la convolución de los múltiples picos de oxidación de PMZ. A pesar de esto, queda claro que el origen de las diferencias en los mecanismos electroquímicos de PMZ sobre GCE/BCNT, GCE/BCNT-dsDNA y GCE/BCNT-ssDNA es la presencia de la doble/simple hebra del DNA y las distintas interacciones que se establecen con PMZ.
Con el fin de analizar sólo la fracción de PMZ que interactúa con las distintas plataformas y eliminar la contribución de las moléculas que difunden desde el seno de la solución, se realizaron experimentos de stripping de adsorción con cambio de medio y detección por DPV (sección 2.2.1).
En la figura 4.7 se muestran los perfiles de DPV obtenidos sobre GCE modificado con BCNT (A), BCNT-dsDNA (B) y BCNT-ssDNA (C) luego de la acumulación de PMZ 5,00 x10-6 M por 5 min y posterior cambio de medio. Se puede observar que la mayor densidad de corriente anódica para PMZ, en consonancia con los resultados obtenidos por voltamperometría cíclica, se obtiene sobre GCE/BCNT-dsDNA.
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Figura 4.7. Perfiles j-E obtenidos por voltamperometría de pulso diferencial (con sustracción de línea de base) sobre GCE modificado con BCNT (A), BCNT-dsDNA (B) y BCNT-ssDNA (C) luego de acumular PMZ 5,00 x10-6 M por 5 min al o.c.p. y posterior lavado con buffer acetato 0,200
M pH 5,00 (trazo lleno) ó con dicho buffer y solución de NaCl 0,200 M (trazo discontinuo). Electrolito soporte: buffer acetato 0,200 M pH 5,00. El inset del panel C muestra una ampliación de la respuesta DPV sobre GCE/BCNT-ssDNA.
Puesto que el DNA tiene densidad de carga negativa, es esperable que se establezca una interacción electrostática atractiva entre PMZ (pKa = 9,10) con ss o dsDNA. Sin embargo, en el caso de la interacción entre PMZ y el dsDNA soportado sobre BCNT debe haber otra contribución, además de la electrostática, que es responsable del importante aumento en la densidad de corriente obtenido sobre esta plataforma. Con el fin de estudiar este comportamiento, se evaluó el efecto de la fuerza iónica (f.i.) en la interacción de PMZ llevando a cabo experimentos de stripping de adsorción en idénticas condiciones a las anteriores pero adicionando al buffer de enjuague una solución de NaCl 0,200 M (f.i.= 0,200 M). Los perfiles de DPV correspondientes se muestran, para las 3 plataformas, en la figura 4.7 con las líneas en trazo discontinuo. Sobre GCE/BCNT- dsDNA y GCE/BCNT-ssDNA se advierte una disminución en la densidad de corriente de oxidación debido a que el medio de lavado de alta f.i. produce la eliminación de PMZ que interacciona electrostáticamente con el DNA.
En la tabla 4.1 se muestran las densidades de corriente de pico (jp) para los perfiles de DPV mostrados en la figura 4.7. Se puede constatar que la disminución de jp para GCE/BCNT luego de lavar con solución de f.i. elevada fue sólo del 2%. Esto se debe a que las moléculas de PMZ se adsorben a través del sistema de anillos conjugados sobre las paredes de C sp2 de BCNT mediante interacciones hidrofóbicas -stacking, las cuales son invariantes a las concentración de sal del electrolito de lavado. Por otro lado, sobre BCNT-ssDNA la densidad de corriente anódica de PMZ adsorbida disminuye un 59% al enjuagar con el medio de mayor f.i., evidenciando que el modo de interacción principal de PMZ sobre el ssDNA soportado sobre los BCNT es de tipo electrostático. Sobre BCNT-
0,400 0,600 0,800 0,0 0,5 1,0 1,5
B
C
j
/m
A cm
-2A
0,400 0,600 0,800 0,0 0,5 1,0 1,5E/V
0,400 0,600 0,800 0,0 0,5 1,0 1,5 0,400 0,600 0,800 0,00 0,06 0,12 0,18105
dsDNA, la reducción en la densidad de corriente es sólo del 11% reforzando la conclusión de que, aunque las fuerzas electrostáticas juegan algún rol en la interacción entre PMZ y BCNT-dsDNA, las fuerzas de van der Waals son las principales responsables de la mayor acumulación frente a las otras plataformas.
Tabla 4.1. Efecto de la solución de lavado de GCE/BCNT, GCE/BCNT-dsDNA y GCE/BCNT-ssDNA conteniendo PMZ acumulada.
jp/mA cm-2 a
Disminución procentual b Lavado con buffer
acetato
Lavado con buffer acetato + NaCl 0,200 M
GCE/BCNT 0,425 0,009 0,415 0,009 2% GCE/BCNT-dsDNA 1,77 0,03 1,55 0,05 11% GCE/BCNT-ssDNA 0,16 0,02 0,057 0,002 59%
a Densidades de corriente de pico (jp) obtenidas de los perfiles de DPV de la
figura 4.7. b Calculado como (jp, buffer – jp, NaCl) 100 / jp, buffer.