B pertussis es capaz de sobrevivir dentro de las células THP-1

Estudios previos de nuestro grupo han demostrado que B. pertussis es capaz de sobrevivir en macrófagos humanos permaneciendo en compartimentos no acídicos con características de endosomas tempranos que favorecen su sobrevida y eventual replicación intracelular [10]. La existencia de una fase intracelular de B. pertussis depende de la capacidad de este patógeno de realizar ajustes fenotípicos que le permitan sobrevivir a las condiciones encontradas en la célula hospedadora y establecer de esta manera un estilo de vida intracelular. En este contexto, se llevó a cabo el estudio de la adaptación del proteoma bacteriano durante la infección intracelular de macrófagos humanos en un intento por caracterizar esta fase de la patogénesis de B. pertussis. Dado que trabajar con macrófagos humanos derivados de monocitos primarios limita la cantidad de muestra disponible, se evaluó la posibilidad de realizar estos estudios utilizando la línea celular THP-1 [45]. Esta línea celular de leucemia monocítica humana se diferencia a macrófagos mediante el tratamiento con ésteres de forbol [46]. A diferencia de otras líneas celulares mieloides humanas, como HL-60 ó U937, las células THP-1 diferenciadas son las que comparten mayores semejanzas con los macrófagos primarios [47], razón por la cual esta línea celular es frecuentemente utilizada como modelo de estudio de la interacción macrófago-patógeno [48-52]. En este contexto se eligió trabajar con células THP-1 diferenciadas a macrófagos por tratamiento con forbol- 12-miristato-13-acetato (PMA, un éster de forbol) y se evaluó si la infección con B.

pertussis reflejaba lo observado con macrófagos primarios, en lo que se refiere a tráfico

intracelular y sobrevida bacteriana [10]. Las células THP-1 fueron diferenciadas con PMA y posteriormente infectadas con B. pertussis en ensayos de protección a polimixina B y se evaluó el número de bacterias intracelulares por recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) y microscopía confocal a las 3, 24 y 48 horas post infección. Dado que la polimixina B no puede penetrar las células eucariotas [53], y por lo tanto es incapaz de inactivar las bacterias que fueron internalizadas por las células THP-1, este tipo de ensayos permite evaluar la viabilidad de las bacterias intracelulares a lo largo del tiempo de infección. La Figura 3.1 muestra que a lo largo de la infección se recuperó un número menor de B. pertussis vivas por célula mediante recuento de UFC. Sin embargo, una fracción importante de bacterias vivas fue recuperada 48 h post infección (Figura 3.1),

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sugiriendo que una proporción significativa de las bacterias internalizadas fueron capaces de evadir la actividad celular bactericida de los macrófagos THP-1.

Figura 3.1: Persistencia intracelular de B. pertussis en macrófagos THP-1. B. pertussis fue

incubada con macrófagos humanos THP-1 (Rib/c 150) por 2 h a 37 °C. Después de tres lavados, las células

fueron incubadas durante 1 h con polimixina B 100 µg/ml para inactivar las bacterias extracelulares. Posteriormente las muestras fueron incubadas durante 0, 21 o 45 h en RPMI-SFB 10% polimixina B (5 μg/ml) y el número de UFC determinado a los distintos tiempos. El número de bacterias viables por célula fue calculado dividiendo el número de UFC por el número de macrófagos viables. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes.

En trabajos previos realizados por nuestro grupo con macrófagos primarios se observó mediante microscopía confocal que, si bien un porcentaje mayoritario de los macrófagos resolvía la infección eliminando completamente las bacterias internalizadas, un porcentaje de los mismos no lograba eliminar las bacterias, observándose un incremento de bacterias a lo largo del tiempo en dicha población [10]. Para evaluar si el mismo patrón se observaba en las células THP-1, la proporción de macrófagos infectados y la distribución de las bacterias dentro de los mismos fueron evaluadas por doble tinción inmunofluorescente y microscopía confocal. La Figura 3.2 muestra que a las 3 h post infección la mayoría de los macrófagos contenían entre 1 y 10 bacterias internalizadas. A las 24 h post infección se observó un incremento en el número de células no infectadas y una disminución en el número de macrófagos conteniendo más de 10 bacterias, indicando que algunos de los macrófagos pudieron eliminar las bacterias intracelulares fagocitadas. Sin embargo, a las 48 h post infección se observó un aumento en el porcentaje de macrófagos infectados con más de 10 bacterias, a expensas de la fracción de macrófagos conteniendo 1 a 10 bacterias, sugiriendo que algunas de las bacterias que sobrevivieron a

0 2 4 6 8 10 3 24 48 B ac ter ias v iab les p o r cé lu la (UF C / célu la)

107 tiempos largos podrían haber sido capaces de duplicar dentro de las células THP-1, un resultado similar al encontrado en macrófagos primarios [10].

Figura 3.2: Cuantificación de la carga bacteriana de macrófagos a diferentes tiempos post- infección. Macrófagos THP-1 fueron incubados con B.pertussis (Rib/c 150) a 37 °C por 2 h, lavados e

incubados con polimixina B para inactivar bacterias extracelulares. A diferentes tiempos post infección las células fueron fijadas y el número de bacteria intracelulares por macrófago (b/c) fue evaluado mediante doble marcación fluorescente. El número de bacterias intracelulares fue determinado mediante microscopía de fluorescencia analizando 100 macrófagos por muestra. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes.

Para continuar la caracterización de la sobrevida intracelular de B. pertussis en macrófagos THP-1 se estudió el tráfico intracelular de las bacterias y su localización a diferentes tiempos post infección mediante microscopía confocal utilizando el marcador de compartimientos lisosomales LysoTracker. Los resultados mostraron que el 71% de las bacterias internalizadas por los macrófagos colocalizaban con LysoTracker luego de 3 h de infección (Figura 3.3). A las 24 h el número de bacterias colocalizando con este marcador alcanzó en promedio el 85%, demostrando que la mayoría de los fagosomas bacterianos se fusionaron con lisosomas en este estadio de la infección (Figura 3.3). Sin embargo, al analizar lo que ocurre a las 48 h post infección, se observó que la mayoría de los fagosomas que contenían a B. pertussis eran LysoTracker negativos; sólo el 40 % de las bacterias colocalizaban con LysoTracker (Figura 3.3). Esta disminución en la colocalización con compartimentos lisosomales coincide con el aumento en el porcentaje de macrófagos infectados con más de 10 bacterias (Figura 3.2), sugiriendo que aquellas bacterias que inicialmente escaparon de la fusión con lisosomas y sobrevivieron

0 20 40 60 80 3 24 48 Ma cr ó fag o s co n ten ien d o b ac ter ias ( %)

Tiempo post infección (h)

Sin bacterias 1-10 b/c 10-20 b/c > 20 b/c

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probablemente se duplicaron permaneciendo en compartimientos no acídicos. Este resultado es similar al encontrado previamente en macrófagos primarios [10].

Figura 3.3: Colocalización de B. pertussis con el marcador acidotrópico LysoTracker a distintos tiempos post infección. Bacterias B. pertussis fueron incubadas con macrófagos THP-1 (Rib/c

150) por 2 h a 37 °C. Los macrófagos infectados con B. pertussis fueron lavados e incubados con polimixina B para inactivar las bacterias extracelulares. Muestras de células tomadas a las 3, 24 y 48 h post infección fueron incubadas con LysoTracker. Las bacterias intracelulares fueron marcadas con un fluoróforo verde antes del análisis por microscopía confocal. Las barras indican el porcentaje de fagosomas positivos para LysoTracker. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos independientes

Para confirmar esta hipótesis, se investigó la viabilidad bacteriana mediante microscopía confocal utilizando una tinción por hibridación fluorescente in situ (FISH) en las muestras de macrófagos infectados. Esta metodología de tinción se basa en la hibridación de una sonda de ADN marcada fluorescentemente con complementariedad al ARN ribosómico bacteriano. Dado que la actividad metabólica de la célula, y por ende su viabilidad, está relacionada con el número de ribosomas que contiene, en esta técnica la intensidad de fluorescencia obtenida es proporcional al número de ribosomas por célula y, por lo tanto, la fluorescencia detectada está relacionada con la viabilidad bacteriana. La ventaja de usar una sonda fluorescente que solo marcará a bacterias viables es que, además de confirmar la viabilidad de bacterias intracelulares, nos permite conocer la localización intracelular de las bacterias vivas. En experimentos control pudimos confirmar que B. pertussis inactivada con polimixina B no se marcan mediante esta técnica. Asimismo, muestras de macrófagos THP-1 no infectados no mostraron tinción por FISH, indicando la especificidad de la sonda utilizada. Muestras de macrófagos THP-

0 20 40 60 80 100 120 3 24 48 C o lo ca lizac ió n ( %)

109 1 infectados con B. pertussis fueron sometidos a tinción con FISH y LysoTracker para evaluar la localización de las bacterias viables. La tinción por FISH y el análisis por microscopia confocal evidenciaron la presencia de bacterias intracelulares metabólicamente activas en todos los tiempos analizados (Figura 3.4). La ausencia de colocalización a las 48 h post infección de las bacterias FISH positivas con el marcador de lisosomas LysoTracker sugiere que B. pertussis sobrevivió en compartimentos no ácidos (Figura 3.4). Cabe destacar que a las 48 h post infección un alto porcentaje de macrófagos contenía más de 20 bacterias FISH positivas que no colocalizaban con LysoTracker, sugiriendo que al igual que en macrófagos primarios, B. pertussis es capaz de sobrevivir y eventualmente duplicar en células THP-1 en compartimentos no acídicos. Estos resultados indican que las células THP-1 pueden ser utilizadas como un modelo de infección de B. pertussis en macrófagos humanos.

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Figura 3.4. Colocalización de B. pertussis metabólicamente activas con el marcador acidotrópico LysoTracker. Macrófagos THP-1 fueron incubados con B. pertussis (Rib/c 150) por 2 h a 37

°C, lavados e incubados con polimixina B antes de la tinción con LysoTracker a las 3, 24 y 48 h post infección. Las bacterias viables intracelulares fueron marcadas de verde con una tinción fluorescente in situ (FISH). Se muestran imágenes representativas de microscopía confocal de macrófagos después de 3, 24 y 48 h post infección.