2. Materiales y métodos
2.13. Construcción de cepas mutantes
Para generar cepas mutantes de B. pertussis por eliminación de genes se utilizó una estrategia de mutagénesis por intercambio alélico descripta por Inatsuka y col. [3]. Esta estrategia involucra dos recombinaciones homólogas entre un vector y el genoma de
B. pertussis que finaliza con la eliminación del gen de interés. Para ello, en primer lugar,
se realiza una construcción de ADN que contiene un alelo truncado del gen de interés, generado en un único marco de lectura, junto a regiones adyacentes homólogas al genoma de B. pertussis a ambos extremos del mismo (Figura 2.1). Las regiones homólogas adyacentes se incluyen para proveer una secuencia de nucleótidos que permite realizar la primera recombinación homóloga entre el plásmido y el genoma de B. pertussis. Esta construcción es ligada al plásmido suicida pSS4245, que no puede duplicar en Bordetella. El plásmido pSS4245 contiene genes de resistencia para los antibióticos ampicilina, kanamicina y estreptomicina permitiendo la selección de bacterias que hayan integrado el plásmido en la primera recombinación homóloga. Además, contiene un gen que codifica para la enzima de restricción I-SceI bajo el control del promotor de la toxina pertussis, que asegura la expresión de esta nucleasa únicamente en bacterias en fase virulenta, es decir, cultivadas en ausencia de moduladores como MgSO4. Asimismo, el
plásmido contiene un sitio de corte para la enzima I-SceI que está ausente en el genoma de B. pertussis (Figura 2.1). La expresión de la nucleasa I-SceI y el corte del genoma en el sitio presente en el plásmido integrado es utilizado para inducir una segunda recombinación homóloga.
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Figura 2.1: Estrategia de construcción de un vector de intercambio alélico para realizar mutagénesis en B. pertussis A) Región genómica que contiene el gen a eliminar en la cepa salvaje. Se
muestran los cebadores utilizados para amplificar por PCR las regiones homólogas adyacentes al gen de interés y generar la construcción para la eliminación (5F y 5R, región corriente arriba; 3F y 3R, región corriente abajo). Se indican los sitios de enzimas de restricción presentes en los cebadores. B) Amplificaciones por PCR de las regiones homólogas adyacentes al gen de interés. C) Plásmido de intercambio alélico pSS4245. Este plásmido contiene la construcción para realizar la mutagénesis, un sitio de restricción de la endonucleasa I-SceI, el gen que codifica para la endonucleasa I-SceI bajo el promotor de la toxina pertussis (ptx) y los genes de resistencia a los antibióticos kanamicina (KmR), estreptomicina
(SmR) y ampicilina (AmpR). El gen SmR es expresado por B. pertussis y no por E. coli.
El plásmido pSS4245 con la construcción para realizar la mutagénesis es introducido en E. coli SM10(λpir) (cepa donante) y transferido a B. pertussis (cepa receptora) mediante conjugación bajo condiciones de cultivo moduladoras (en presencia de MgSO4 50 mM), para mantener la fase avirulenta y así evitar la producción de la
endonucleasa I-SceI. Las bacterias que integran el plásmido por recombinación entre las regiones homólogas del mismo y el genoma son seleccionadas en un medio de cultivo con ampicilina 30µg/ml, estreptomicina 100 µg/ml y kanamicina 40 µg/ml (Figura 2.2- I). El gen que codifica la resistencia a estreptomicina solamente es expresado por B.
pertussis, permitiendo eliminar las bacterias E. coli usadas como cepa parental en la
conjugación. Los clones transconjugantes de B. pertussis obtenidos luego de esta primera recombinación son merodiploides: contienen una copia salvaje y una copia mutante del gen a eliminar en su genoma (Figura 2.2-II). La segunda recombinación homóloga, que involucra la eliminación del plásmido integrado en el genoma junto con una copia del gen, ya sea el salvaje o mutante, se induce al cultivar los clones transconjugantes en ABG sin MgSO4 (condiciones no moduladoras) que inducen la fase virulenta. Este pasaje a fase
A)
B)
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virulenta activa la expresión de la endonucleasa I-SceI, que corta al genoma en un sitio de restricción presente únicamente en la secuencia del plásmido integrado (Figura 2.2- III). Esta rotura de doble hebra del ADN genómico activa mecanismos de reparación que inducen una segunda recombinación homóloga, generando clones con la copia del alelo salvaje o la copia mutante por eliminación, con la consiguiente pérdida del plásmido junto con la otra copia del alelo (Figura 2.2-IV). Mediante PCR se analizan los clones obtenidos para identificar aquellos que den amplificaciones correspondientes a una cepa mutante por eliminación.
Figura 2.2: Esquema de las recombinaciones homólogas realizadas para obtener una cepa mutante. I) Primera recombinación entre las regiones homólogas del plásmido pSS4245 y el genoma de
B. pertussis. II) La integración del plásmido en el genoma de B. pertussis genera una cepa merodiploide
que contiene una copia del gen salvaje y una copia mutante. III) Al subcultivar los clones merodiploides en medio sin modulador de fase se induce la expresión de la nucleasa I-SceI, que corta el genoma de B.
pertussis en el sitio I-SceI codificado en el plásmido pSS4245 integrado. Se produce entonces la segunda
recombinación homóloga, existiendo dos posibilidades, A y B. IV) Esquema del genoma después de la segunda recombinación homóloga. La recombinación A da una cepa tipo salvaje (wt) mientras que la recombinación B da una cepa tipo mutante (ΔgenX). AtbR: genes de resistencia a los antibióticos
kanamicina, ampicilina y estreptomicina. Pptx: promotor de la toxina pertussis.
I)
II)
III)
89 Las amplificaciones mediante PCR de los fragmentos de ADN correspondientes a las regiones adyacentes al gen a eliminar se realizaron utilizando ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 (New England Biolabs, Massachusetts, EE. UU.) y ADN genómico de
B. pertussis Tohama como molde. La región corriente arriba adyacente del gen a eliminar
fue amplificada usando los cebadores 5F y 5R correspondientes y la región corriente abajo utilizando los cebadores 3F y 3R (Tabla 2.3). Los cebadores utilizados contienen en su secuencia un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción para facilitar los pasos posteriores (Tabla 2.3). Los productos de PCR de aproximadamente 750 pb fueron escindidos por las respectivas enzimas de restricción (New England Biolabs) y ligados utilizando la enzima ADN ligasa T4 (New England Biolabs). Este producto fue posteriormente utilizado en una ligación con el plásmido de intercambio alélico pSS4245. El plásmido resultante posee un inserto que contiene una versión truncada del gen a eliminar generada en un único marco de lectura y sin marcadores de selección junto con las regiones circundantes corriente arriba y corriente abajo del gen (Figura 2.1C). El plásmido pSS4245 resultante fue introducido en la cepa E. coli SM10(λpir) (cepa donante) y transferido a B. pertussis Tohama (cepa receptora) mediante conjugación, como se describe en Inatsuka y col. [3]. Como resultado de dos eventos de recombinación posteriores, se obtuvo una cepa que contiene una eliminación cromosómica del gen de interés. Los clones mutantes son seleccionados mediante PCR con los cebadores 5F y 3R correspondientes, que permiten distinguir según el tamaño de la amplificación obtenida entre clones salvajes o mutantes por eliminación del gen de interés. La eliminación del gen y las secuencias de sus regiones adyacentes en la cepa mutante se confirmaron mediante secuenciación de ADN.
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Tabla 2.3: Cebadores utilizados para construir cepas mutantes. Los sitios de enzimas restricción agregados se encuentran subrayados.
Cebador Secuencia Sitio de restricción
bfrDE-5F CTGCGGCCGCCGTGTACTTCGACGATCCGG NotI bfrDE-5R GAACTAGTCATGGGAATCCGCTATCGTC SpeI
bfrDE-3F CTACTAGTTATTGAGCGCAGCCGCGC SpeI
bfrDE-3R GAGAATTCGTTCAACGAGACGATCCGCG EcoRI
irp1-3-5F AAACAATTGGGAAATCCAGCAGCGC MfeI
irp1-3-5R AAAGGATCCCATCATGTACGAGTCC BamHI
irp1-3-3F AAAGGATCCGTACTGATCGTGCGTG BamHI
irp1-3-3R AAACAATTGGCCCACCACCAGCAGG MfeI
mgtC-5F CTGCGGCCGCCCTTCGGCAATCAGCGTCATG NotI
mgtC-5R GAACTAGTCATGGCTGCGTGCTCCCGG SpeI
mgtC-3F CTACTAGTAAGCGGGTCGTCGCGCAGC SpeI
mgtC-3R GAGGATCCCCTGGAAATCCTGGTCGATC BamHI