A continuación se muestra un ejemplo del cálculo del peso molecular de una proteína desconocida. Junto a la corrida electroforética de las muestras se aplicaron patrones de peso molecular, es decir, diferentes proteínas con valor de peso molecular conocidos.
En la tabla 8.1 se muestran los datos necesarios para el cálculo del peso molecular de la proteína desconocida.
Tabla 8.1. Cálculo del peso molecular de proteína desconocida
Marcador de PM PM (kDa) Log PM Distancia recorrida (mm) Rf Albúmina bovina 66 1,82 6,5 0,093 Ovoalbúmina 45 1,65 13,0 0,186 Gliceraldehido 3P deshidrogenasa 36 1,56 18,0 0,257 Anhidrasa carbónica 29 1,46 25,0 0,357 Tripsinógeno 24 1,38 28,5 0,407 Inhibidor de tripsina 20,1 1,303 38,0 0,543 Α lactoálbumina 14,2 1,152 50,0 0,714 Proteína problema ? ? 44,0 0,628
Nota: la Rf o movilidad relativa de las fracciones, es el cociente entre la distancia recorrida por la proteína (desde el origen de aplicación hasta el centro de la mancha) y la distancia desde el origen hasta el frente de corrida, que en este ejemplo fue de 70 mm.
Con estos datos se construye un gráfico en Excel (grafico de dispersión o scatter plot) con el valor del Rf en el eje de las abcisas y el logaritmo del peso molecular de las proteínas patrones en el eje de las ordenadas (Fig. 8.5). A partir de la ecuación de la recta de regresión, y sustituyendo el valor del Rf de la proteína problema se obtiene:
y = -1,0313x + 1,8517 log PM = - 1,0313 (0,628) + 1,8517 log PM = 1,2037
PM = antilog 1,2037 PM = 15,98 kDa
Sustituyendo los valores de Rf de la proteína problema en la ecuación de la recta de regresión y hallando el antilogaritmo se obtiene un PM de 15,98 kDa.
Fig. 8.5. Curva de calibración con las proteínas de peso molecular conocido.
Electroforesis de las proteínas plasmáticas
El plasma humano contiene más de 100 proteínas diferentes, cada una con una función y sujetas a variaciones individuales en condiciones normales, pero más aun en estados patológicos. Desde la introducción por Tiselius de las primeras técnicas electroforéticas y luego con la aparición de la electroforesis de zona, las proteínas plasmáticas han sido caracterizadas en 5 fracciones: la albumina
y las globulinas alfa (α1 y α2), beta (β) y gamma (γ). Cada una de estas bandas o fracciones contiene varias proteínas.
En las electroforesis de las proteínas del plasma no se hace referencia al fibrinógeno, ya que normalmente es consumida esta proteína en el proceso de coagulación de la sangre para obtener el suero, que es el material biológico utilizado comúnmente en las electroforesis.
En la figura 8.6.A se aprecia un esquema de un densitograma normal de las proteínas plasmáticas y en la figura 8.6.B la imagen de los geles de agarosa correspondientes a un grupo de pacientes. Para la cuantificación, primero se realiza la determinación total de proteínas por un método como el Biuret, y después de acuerdo con los porcentajes de absorbancia relativa de cada fracción se calculan los gramos de cada banda.
Fig. 8.6. A: esquema del electroforetograma; B: resultado de las corridas electroforéticas de varios pacientes. A
B
Se han logrado identificar los principales componentes de las 5 bandas que se distinguen en el electroforetograma, así como algunas implicaciones médicas asociadas a las alteraciones de esas bandas:
1. Albumina.
La albumina es una proteína plasmática que se une con ácidos grasos libres, con la bilirrubina, y con medicamentos como el ácido acetilsalicílico y la
penicilina. Una disminución de esta fracción se produceen los estados de desnutrición, en enfermedades hepáticas, en el síndrome nefrótico y en enfermedades intestinales asociadas a pérdidas de proteínas.
2. Alfa1-globulina.
Esta banda contiene a la α1-antitripsina y la α1-glicoproteína ácida (el componente principal es el primero). La fracción de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) migra entre la albumina y la banda de las α1, y altos niveles de alfa-feto proteína, como ocurre en el carcinoma hepático, se reflejan en una banda estrecha que aparece entre la albumina y la banda α1. La disminución de esta banda de la α1 se observa en el síndrome nefrótico y su incremento en los procesos infecciosos agudos. La proteína de Ben- ce-Jones, sugestiva de mieloma múltiple, puede aparecer en esta banda α1 y retardar su movilidad.
3. Alfa2-globulina.
Esta banda tiene dos componentes principales la α2-macroglobulina y la haptoglobina. La primera se observa elevada, principalmente en el síndrome nefrótico, y puede incrementarse hasta 10 o más veces. La haptoglobina se eleva en los procesos infecciosos agudos y se halla disminuida en las anemias hemolíticas. En esta clase de anemias se forma un complejo entre la hemoglobina liberada de los eritrocitos y la haptoglobina, el cual es rápidamente degradado por los macrófagos. En esta fracción también se encuentra la ceruloplasmina, proteína transportadora de cobre.
4. Betaglobulina.
En esta fracción migran proteínas como la transferrina, y la β-lipoproteína que lo hacen en la subfracción β1, y el complemento C3y la hemopexina que lo hacen en la subfracción β2. Un incremento de la fracción de las betaglobulinas ocurre cuando se eleva la fracción de LDL-colesterol en plasma. En la anemia ferripriva la transferrina aumenta, así como esta banda. También se puede observar un incremento en el embarazo, así como en el tratamiento con estrógenos.
En la fracción β también se localiza la transcobalamina, proteína encargada del transporte de la vitamina B12 en plasma. Aquí aparece la fibronectina migrando, la que aumenta en la colestasis hepática, en las neoplasias y en el síndrome nefrótico, y disminuye en quemaduras intensas, politraumatismos y sepsis.
En la fracción β2 migra la proteína fibrinógeno del plasma, pero esta pro- teína se consume en el proceso de coagulación de la sangre y, por lo tanto, ya no esta presente en la electroforesis del suero humano. La proteína C reactiva, que se observa aumentada en procesos infecciosos, aparece entre las bandas beta y gamma provocando una fusión de ambas.
5. Gammaglobulinas (banda gamma).
Las inmunoglobulinas (Ig) G, M, A, D y E, son las únicas proteínas que aparecen en la banda gamma. El incremento de algunas de estas fracciones es útil para el diagnóstico de infecciones crónicas, mieloma múltiple y otras afecciones.
Hay veces que el incremento de esta banda se observa en forma de pico, lo cual sugiere la presencia de un anticuerpo monoclonal. El mieloma, la leucemia linfocítica crónica y el linfosarcoma producen estos picos en la banda gamma. Otras veces están presentes anticuerpos policlonales y se observa un ensanchamiento de la banda como es en el caso de una infección crónica, la enfermedad hepática crónica, el lupus eritematoso, la artritis reumatoide y otras enfermedades del tejido conectivo.
La hipogammaglobulinemia puede observarse en niños y también puede observarse la agammaglubulinemia como un trastorno genético ligado al cro- mosoma X.
Los valores normales para las distintas bandas se muestran a continuación y en la figura 8.7 algunos electroforetogramas, normal o característico de algunas afecciones. Bandas g/dL Proteína total 6,4 a 8,3 Albúmina 3,5 a 5,0 Alfa1-globulina 0,1 a 0,3 Alfa2-globulina 0,6 a 1,0 Betaglobulina 0,7 a 1,2 Gammaglobulina 0,7 a 1,6