Aunque este aspecto está más relacionado con la medicina en general; como ejemplo de enzimas útiles en el tratamiento médico se puede mencionar la es- treptoquinasa (la cual se obtiene del estreptococo hemolítico o por ingeniería genética), capaz de disolver coágulos en el músculo cardiaco a consecuencia de un infarto.
La estreptoquinasa activa el precursor de la plasmina de la manera siguiente:
Aunque existen activadores fisiológicos del plasminógeno, como la uroqui- nasa producida en el riñón (proteasa de serina), la estreptoquinasa muestra una gran actividad funcional.
Otras enzimas (como: α-quimotripsina, tripsina y desoxirribonucleasa) han sido utilizadas en el tratamiento de abcesos, quemaduras, úlceras infectadas de la piel y cervicitis de la mujer.
En deficiencias digestivas de enzimas y de pancreatitis se han utilizado pepsina, lipasa y amilasa.
Otro ejemplo es el de la asparaginasa, utilizada en el tratamiento de la leucemia, ya que en estos pacientes las células tumorales requieren de gran cantidad del ami- noácido asparagina para su crecimiento y esta enzima deprime los niveles en plasma. También se vislumbra en medicina el empleo de una enzima capaz de remover los radicales superóxido (O2-), como es la superóxido dismutasa.
Las enzimas se utilizan como reactivos en algunas aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, la enzima β-galactosidasa, fijada a una matriz, es capaz de dismi- nuir la lactosa en la leche; así, este alimento puede ser utilizado en pacientes con intolerancia a este disacárido.
Los pediatras conocen bien el cuadro clínico que se origina en niños pequeños con relativa frecuencia, como consecuencia de una infección gastrointestinal, en el que se produce una deficiencia transitoria de la enzima lactasa. En estas circunstancias, el elemento más importante que se ha de tener en cuenta, en el tratamiento, es la supresión absoluta, o casi absoluta, de la lactosa en la dieta; pero el alimento más rico en lactosa es la leche, un alimento muy completo para la buena nutrición de los niños. La administración de leche sin lactosa o con bajo contenido de este disacárido, permite realizar un tratamiento adecuado sin detrimento de la administración de otros nutrientes importantes para el niño.
Electroforesis
Es una de las técnicas de separación de moléculas. La separación, identifi- cación y caracterización de distintas biomoléculas en una mezcla compleja ha sido y es en la actualidad una de las tareas comunes e importantes que deben realizar los bioquímicos en su trabajo cotidiano. Para lograr ese objetivo de separar una mezcla compleja de biomoléculas, se han ideado diversas técnicas, algunas de estas se utilizan preferentemente con fines investigativos, ya sea en la variante analítica o preparativa; otras se utilizan con propósitos para el diagnóstico médico en el laboratorio clínico.
Entre estas técnicas de separación de biomoléculas se encuentran la elec- troforesis y la cromatografía, cuyos principios y principales aplicaciones son revisados en este y el capítulo que sigue.
La electroforesis es una técnica utilizada con bastante frecuencia en los labo- ratorios clínicos y más aun en los que se dedican a investigaciones en el campo de la bioquímica o de la biología molecular. Electro se refiere a electricidad y foresis, del griego phoros, significa traslada.
La electroforesis se basa en la separación de las moléculas de una mezcla o disolución según la movilidad de estas en un campo eléctrico. Las moléculas con carga positiva o negativa se moverán hacia el cátodo o el ánodo, respecti- vamente, es decir, hacia los polos opuestos a su carga eléctrica. La separación puede realizarse sobre una superficie o soporte sólido e hidratado (por ejemplo, electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o a través de una matriz poro- sa (electroforesis en gel) o en disolución (electroforesis libre), aunque las dos primeras se emplean con más frecuencia hoy día.
Independientemente de la técnica que se emplee, la separación obedece a dos factores principales: la carga eléctrica de las moléculas y su masa. En alguna medida la forma también influye, pues con moléculas no esféricas la fricción desempeña un papel importante.
La variante más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, casi siempre de agarosa o de poliacrila- mida (es común que esta última sea nombrada PAGE, por sus siglas en inglés). También la electroforesis se puede utilizar para separar otras biomoléculas que poseen grupos ionizables como heteropolisacáridos, péptidos y aminoácidos.
La carga eléctrica de macromoléculas como las proteínas y los ácidos nuclei- cos, de algunos polisacáridos, depende de los monómeros constituyentes, así como del medio en que estas macromoléculas se encuentren disueltas.
En el caso de las proteínas, son los grupos laterales o cadenas R de los aminoácidos los que pueden conferirle la carga; el grupo amino y el carboxilo terminal también pueden ser responsables de esa carga, aunque solo son dos grupos por cadena polipeptídica. El estado de ionización de esas cadenas late- rales y por ende la carga eléctrica depende del pH del medio y del pKa de esos grupos químicos.
La carga neta de la proteína es, por tanto, la sumatoria de cargas positivas y negativas a un determinado pH. Asimismo, existe un valor de pH, denominado punto isoeléctrico (pI), donde la proteína tiene una carga neta igual a cero, y en ese caso no migra a ninguno de los dos polos. Por debajo del punto isoeléctrico las proteínas siempre tienen carga eléctrica positiva y, por encima, negativa, lo cual puede ser demostrado de forma teórica. La carga eléctrica de proteínas conjugadas como las glicoproteínas o nucleoproteínas puede depender, además, de los grupos químicos de la parte no proteica.
En un caso particular de electroforesis en geles de poliacrilamida, la carga eléctrica no se debe, en sí misma, a la carga de las proteínas, sino a la unión de estas moléculas con el dodecilsulfato de sodio (SDS), un detergente aniónico que es el que les confiere la carga. Este reactivo incorpora cargas negativas de manera dependiente de la masa molecular de la proteína;en este caso se trata de un tipo de electroforesis desnaturalizante en la que las proteínas pierden su estructura tridimensional por efecto del calor y de la presencia de otros dos agentes desnaturalizantes: el β-mercaptoetanol, que rompe los puentes disulfuro, y el dodecilsulfato de sodio que desnaturaliza y recubre a la proteína.
La unión masiva de moléculas de dodecilsulfato de sodio bloquea la carga propia de la molécula de proteína y le confiere al complejo dodecilsulfato de sodio-proteína una carga neta negativa proporcional a su masa, haciendo que todas las proteínas unidas con el dodecilsulfato de sodio viajen hacia el ánodo.
Por otro lado los ácidos nucleicos deben su carga negativa a los grupos fosfatos del eje covalente o parte constante de esta macromolécula, que a pH neutro están totalmente disociados, ya que el pKa de los grupos fosfatos es mucho menor que 7.
Al someter la mezcla de estas biomoléculas, ya sean proteínas o ácidos nuclei- cos, a un campo eléctrico, estas se mueven y van atravesando la malla de fibras del gel o del papel de acetato de celulosa. Las más pequeñas avanzan más y las más grandes quedan cerca del lugar de partida después de un tiempo determinado.
Por lo general, para caracterizar la molécula se determina la velocidad a la que esta se mueve en un campo eléctrico y su localización final en el soporte. En el caso de las proteínas se puede conocer o determinar la masa molecular o detectar cambios de aminoácidos o separar, cuantitativamente, distintas es- pecies moleculares. En el caso de los ácidos nucleicos se determina el tamaño del fragmento, medido en pares de bases.
De la interacción del campo eléctrico con la molécula cargada surge una fuerza sobre la molécula y esta experimenta una aceleración hasta obtener una velocidad en la que la fricción, por la viscosidad del medio, neutraliza la fuerza impulsora. A partir de ese instante la molécula se desplaza con una velocidad constante.
Si la fuerza del campo eléctrico es: F = qE Donde:
q: carga; E: intensidad del campo eléctrico.
Y si la fuerza de fricción, asumiendo que la partícula es esférica, es igual a: Fr = 6πRηV
Donde:
Fr: fuerza de fricción; R: radio de la esfera; V: velocidad; η: viscosidad del fluido.
Al ser iguales ambas fuerzas después de iniciado el movimiento de las mo- léculas, cuando es alcanzada una velocidad constante, se obtiene entonces que la velocidad es:
V = qE/6πRη (8.1)
Por otra parte, la movilidad molecular (μ) es una magnitud característica de la partícula o molécula, que se define como la velocidad relativa a la intensidad del campo eléctrico, es decir:
μ = V/E
A partir de la ecuación (8.1), sustituyendo el valor de la velocidad se obtiene que: μ = q/6πRη (8.2)
Donde se puede apreciar que la movilidad es directamente proporcional a la carga (q) y función inversa del radio (R) de la molécula, es decir de su tamaño.
La carga de la molécula, a su vez, depende del pH del medio en el que se encuentre y por esta razón es necesario indicar el electrolito o, más importante aun, el pH utilizado para determinar la movilidad. Téngase en cuenta que en la expresión (8.2) se considera que la molécula es una esfera de radio R, pero eso puede ser diferente con proteínas o moléculas no esféricas, y en ese caso la fricción suele ser mayor.
La corriente que atraviesa la disolución entre los electrodos es conducida, principalmente, por los iones del tampón, si bien una pequeña proporción lo es por los iones de la muestra. La relación entre intensidad (I), tensión (V) y resistencia (R) se expresa según la ley de Ohm:
R = V/I
Esta ecuación muestra que, para una resistencia constante, es posible acele- rar la separación electroforética aumentando la intensidad del campo eléctrico aplicado, lo cual da lugar al correspondiente incremento de la intensidad de la corriente. La distancia recorrida será proporcional a la intensidad y al tiempo. Con todo, el aumento de tensión o voltaje (V) y el incremento correspondiente de intensidad (I) ocasionaría uno de los principales problemas que plantea la mayor parte de las diversas técnicas de electroforesis: la generación de calor.
Este fenómeno queda ilustrado con la ecuación, en la que la potencia (W, medida en joules/s) generada durante la electroforesis equivale al valor de la resistencia multiplicado por el cuadrado de la intensidad:
W = I2R
Dado que la mayor parte de la potencia producida en el proceso electroforé- tico se disipa en forma de calor, pueden producirse los efectos perjudiciales siguientes:
1. Aumento de la tasa de difusión de los iones de la muestra y del tampón, con el consiguiente ensanchamiento de las muestras separadas.
2. Formación de corrientes de convección, con la consiguiente mezcla de las muestras separadas.
3. Inestabilidad térmica de las muestras, que son bastante sensibles al calor; por ejemplo, desnaturalización de las proteínas o del ácido desoxirribonu- cleico (ADN).
4. Disminución de la viscosidad del tampón y, por ende, reducción de la resistencia del medio.
En resumen, varios factores pueden influir en el resultado de una electrofo- resis, como son:
2. Carga eléctrica de las moléculas.
3. Masa molecular de las moléculas que se han de separar. 4. Forma tridimensional de las moléculas.
5. Temperatura, ya que el paso de corriente produce calor y este puede afectar las moléculas desnaturalizándolas, alterando, además, la calidad de la sepa- ración. Esta es la razón por la cual algunos equipamientos de electroforesis poseen un sistema de enfriamiento, muchas veces por recirculación de agua, con la finalidad de evitar altas temperaturas en la cámara de corrida. 6. Fuerza iónica de la disolución donde se encuentran las moléculas cargadas,
ya que, si es menor, permite mayor movilidad y menos desprendimiento de calor.