Calidad nutricional in vitro

Se determinó la composición porcentual de los panes óptimos y del pan secado y molido que se emplearon para la realización de la dieta de los ensayos in vivo. Sobre los panes óptimos se determinó además de la composición porcentual, la digestibilidad de almidón y la disponibilidad de hierro y calcio.

2.2.15.1.1. Composición porcentual

Se determinó el contenido de cenizas, proteínas, humedad y fibra dietaria total según lo descripto en la sección 2.2.1. Y el contenido de lípidos se determinó empleando el método de ratzlaff según método 30-10-01 (AACC, 2000).

Determinación del porcentaje de Inulina-FOS del pan seco y molido (CA4)

Una suspensión de pan al 10% p/v en agua destilada se la coloca en un baño de agua a 85 ºC con agitación constante durante 30 min. La inulina y FOS se solubilizan en agua. Concluido el tiempo se filtra una porción de la solución acuosa, colocando el filtrado en un tubo eppendorf listo para ser inyectado en el cromatógrafo. Se utilizó la técnica de HPLC (High Performance Liquid Chromatography) empleando una columna de intercambio iónico y un detector de índice de refracción. Flujo = 0,7 ml/min. Se utilizó una suspensión de Synergy1 como patrón. Se obtuvo el tiempo de retención del pico y las áreas de pico a partir de las cuales se calculó el porcentaje de prebiótico como:

Ec. 2.36

donde:

A pan: Área del pico obtenida a partir de la solución acuosa de pan A patrón: Área del pico obtenida a partir de la solución acuosa de patrón 10: factor de dilución.

2.2.15.1.2. Digestibilidad de almidón

Para medir la digestión del almidón se utilizó el método in vitro reportado por Holm y col. (1985). Se determinó la tasa de hidrólisis in vitro del almidón de un alimento tal como se ingiere como una medida de la digestibilidad del almidón. El polisacárido es hidrolizado con α-amilasa, se reduce a azúcares los cuales son expresados como equivalentes de maltosa determinados espectrofotométricamente.

Reactivos utilizados

 Buffer fosfato: se disuelven en 700 ml de agua 3,03 g KH2PO4, 3,96 g Na2HPO4.2H2O y 0,40 g NaCl. Se lleva a pH 6,9 y a 1 litro en matraz aforado.

 Reactivo de 3,5 dinitrosalicílico (DNS): se disuelve en cierta cantidad de agua destilada 10,0 g de ácido 2,3 dinitrosalicílico, 300 g tartrato de sodio y potasio tetrahidratado y 16 g de NaOH. Se lleva a 1 litro.

% syn =

A

A

 α-amilasa Tipo IA 1200 U/mg (Sigma): Diluir 56 µl de enzima con 16 ml de buffer fosfato (preparados dentro de los 30 minutos previos al comienzo de la hidrólisis).  maltosa anhidra: solución patrón 0,2 mg/ml en agua destilada.

Protocolo

En este ensayo a 500 mg de almidón o su equivalente se le añaden 50 ml de buffer fosfato y se incuba a 37 °C con agitación constante. En nuestro caso el equivalente resultó ser la miga de los tres panes óptimos y del pan control, considerando el contenido de hidratos de carbono totales como almidón. Antes de adicionar la enzima, se tomaron dos alícuota de 0,2 ml cada una para marcar como tiempo cero. Posteriormente se adicionó la enzima α-amilasa y a los 5, 15, 30 y 60 min se tomaron alícuotas de 0,2 ml, los cuales se colocaron en tubos de ensayo conteniendo 0,8 ml de agua destilada. Los tubos fueron calentados en un baño de agua en ebullición por 10 min. Una vez frio, se les agregó 1 ml de reactivo de DNS en todos los tubos y se colocaron en baño maría nuevamente durante 10 minutos para favorecer la reacción de los azúcares reductores (principalmente lactosa) con el DNS. Luego se añadieron 15 ml de agua destilada realizando una buena homogenización de la mezcla. Se leyeron las absorbancias a 530 nm en paralelo con una curva estándar de maltosa (0 - 2 mg maltosa/ 2 ml). Finalmente se calculó la tasa de hidrólisis como los mg de maltosa/g almidón liberada durante la hidrólisis. La masa de almidón se calculó teniendo en cuenta la cantidad de harina de cada formulación

2.2.15.1.3. Disponibilidad de hierro, calcio y cinc

Se analizó la dializabilidad de estos minerales, como un indicador de la biodisponibilidad potencial por medio del método in vitro de Miller y col. (1981), modificado por Wolfgor y col. (2002). El procedimiento involucra una digestión enzimática en condiciones que simulan las fisiológicas.

Reactivos utilizados

 Solución α -amilasa (SIGMA): 6 g de amilasa/100 ml de agua.  HCl 6N valorado

 Solución de pepsina (SIGMA): 16 g de pepsina/100 ml de HCl 0,1 N.

 PIPES (SIGMA P-3768): Concentración calculada en base a los meq totales calculados.

 Solución de bilis-pancreatina: 2,5 g bilis y 0,4 g de pancreatina en 100 ml de NaHCO3 0,1 N.

Protocolo

A 15 g de pan molido en una procesadora se le adicionó 7 ml de una solución acuosa al 3% de α-amilasa y 45 ml de agua destilada. Se incubó durante 30 min a 37 °C con agitación.

Se ajustó el pH en 2 con solución valorada de HCl 6 N y se agregaron 1,6 ml de pepsina-HCl, incubándose la mezcla a 37 ºC durante 2 hs, con agitación (digestión estomacal).

Dos alícuotas de 15 g del digerido se colocaron en frascos limpios con bolsas de diálisis (Spectrapore Molecular Weight cut-off 6000-8000) conteniendo 18,75 ml de buffer PIPES 0,15 M y pH variable. El pH del buffer a utilizar se establece luego de hacer ensayos previos en base a la matriz alimentaria en estudio, para obtener un pH final uniforme de 6,5 ± 0,2, al final de la segunda incubación a 37 ºC.

Después de una hora de incubación, cuando el pH alcanzó un valor mínimo de 4,5 se agregaron 3,75 ml de una mezcla de bilis-pancreatina prosiguiéndose la incubación durante dos horas a 37 ºC (digestión intestinal).

Las bolsas de diálisis fueron removidas y enjuagadas con agua ultra pura y los dializados se transfirieron a tubos tarados y se pesaron. Se procedió a la mineralización de los dializados con mezcla HNO3 y HClO4 en partes iguales a 140 ºC durante 2 hs. Se determinó el contenido total de minerales por espectroscopia de absorción atómica y se calculó la dializabilidad mineral porcentual (DM) según la ecuación 2.37 como:

Ec. 2.37

donde:

md: masa del mineral M en el dializado. Expresada en miligramos (mg). mD: masa del mineral M total en la muestra digerida. Expresada en mg.

DM = md mD

Determinación de calcio, hierro y cinc.

El contenido de calcio, hierro y cinc en las muestras se determinaron (previa mineralización por vía húmeda con mezcla nitro-perclórica) utilizando un espectrofotómetro de absorción atómica (Perkin Elmer AAnalyst 400, Estados Unidos), con llama de aire-acetileno, slit de 0,5 mm y longitud de onda de 422,7 nm para el calcio, de 248,3 nm para hierro y de 213,9 nm para el cinc. Se agregó cloruro de lantano, 6500 ppm en la solución de lectura, para evitar interferencias de fósforo en la determinación del calcio (AOAC, 2000). El material de referencia NIST 8435 RM (leche entera en polvo) también fue sometido a un tratamiento idéntico para verificar la exactitud de los procedimientos analíticos.