Evaluación estructural de las masas

Se realizaron diferentes ensayos para evidenciar la posible interacción entre los diferentes componentes de la masa, y poder dilucidar alguna conclusión respecto a la estructura de la misma. Se emplearon las técnicas de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) para estudiar la movilidad molecular, microscopia electrónica de barrido (SEM) para visualizar la masa a nivel molecular. El posible efecto de las diferentes sales de calcio y del prebiótico sobre las proteínas que conforman la red de gluten se estudió por espectroscopia infrarroja en la que se analizó la estructura secundaria de las proteínas de gluten y mediante análisis de gliadinas y gluteninas por electroforesis (SDS-PAGE).

2.2.8.1. Movilidad molecular

La movilidad molecular de las diferentes masas se analizó mediante ensayos de relajación empleando un equipo de baja resolución Brücker Minispec (Brücker, Estados Unidos). Una porción de masa fue introducida en el tubo de vidrio de 1 cm de diámetro, hasta alcanzar los 3 cm de altura y los tubos fueron cerrados para evitar la deshidratación de la masa. Los núcleos son excitados por unos pocos milisegundos y cuando el pulso se detiene, vuelven al estado fundamental emitiendo una señal. En la curva de relajación obtenida se registra la intensidad de señal del protón (1H) en función del tiempo registrándose un decaimiento exponencial de la señal. Se midió la intensidad de señal en el tiempo usando una secuencia de pulso de Carr–Purcel– Meiboon–Gill con un tiempo entre pulsos de 200 μs. El empleo de secuencia de pulsos es necesario cuando se miden tiempos de relajación del orden de los milisegundos. El decaimiento de la Intensidad de señal en el tiempo (Figura 2.12) se modeló con una ecuación exponencial (Ec. 2.30), obteniéndose los tiempos de relajación spin-spin (λ) de los núcleos de hidrógeno presentes en la masa. Esta medida fue realizada por cuadruplicado a temperatura ambiente (20 ºC).

Figura 2.12. Grafico típico de intensidad de señal en función del tiempo del ensayo de relajación de masa.

La señal de eco de espín en t = 0 es proporcional al número de núcleos de hidrógeno de cada especie. En el presente trabajo, las curvas de decaimiento se ajustaron utilizando la Ec. 2.30 mediante el programa OriginPro 8 (Estados Unidos).

I = A * exp (- t / λ) Ec. 2.30

donde:

I = Intensidad de señal.

A = factor pre-exponencial. Representa la intensidad de señal de los protones a tiempo cero.

λ = tiempo de relajación spin-spin (λ) de los núcleos de hidrógeno. Se expresa en milésimas de segundo (ms).

t = tiempo (ms).

2.2.8.2. Microscopia electrónica de barrido

Para la visualización de la microestructura de la masa se empleó la técnica de microscopia electrónica de barrido (SEM).

Se sumergieron piezas cilíndricas de masas de 4 mm de diámetro y 5 mm de alto en glutaraldehído 2,5% v/v para su óptima conservación. Luego se lavaron dos veces con buffer fosfato 0,5 M antes de su deshidratación. La deshidratación se llevó a cabo mediante una seria graduada de acetona: 25%, 50%, 75%, y tres veces con acetona 100%. 0 30 60 90 0,0 0,5 1,0 1,5 In te n s id a d Tiempo (s)

El secado de las muestras se realizó en el punto crítico con CO2 (Bray, 2000). Las muestras se cubrieron con oro en un recubridor sputter (Pelco, Redding, Estados Unidos) y fueron observadas a 5 Kv en un JEOL JSM 35 CF Microscopio Electrónico de Barrido (Tokio, Japón).

2.2.8.3. Propiedades estructurales de las proteínas

2.2.8.3.1. Perfil de gliadinas y gluteninas

Los cambios en el perfil electroforético de las proteínas que forman el gluten, gliadinas y gluteninas, como consecuencia de su posible interacción con la inulina y las sales agregadas se analizaron por SDS-PAGE.

Extracción secuencial de las fracciones proteicas

Las distintas fracciones proteicas fueron extraídas a partir de las diferentes masas liofilizadas y de las harinas empleando extracciones consecutivas con diferentes solventes según la secuencia de Osborne modificada. Para la extracción de albúminas se empleó agua destilada, para las globulinas un buffer Tris- HCl 50 mM (pH 7,8) conteniendo KCl 100 mM y EDTA 5 mM; las gliadinas se extrajeron con 1-propanol (50% p/v) y finalmente se utilizó una solución de ácido acético 0,1 M para extraer las gluteninas.

Se pesaron 3 g de masa liofilizada o harina, se le agregó 15 ml del solvente de extracción, se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Una vez cumplido este periodo las suspensiones fueron centrifugadas (centrífuga Avanti J-25- Beckman Coulter, California, Estados Unidos) a 12096 g durante 15 min a 4 ºC. Se separó el sobrenadante del precipitado y a éste último se le agregaron nuevamente 15 ml del solvente de extracción. Se agitó 15 minutos y se centrifugó en las mismas condiciones detalladas anteriormente. Sobre el precipitado obtenido se agregó el segundo solvente de extracción y se procedió igual que con el primer solvente. Y así sucesivamente con el resto de los solventes. Sólo las proteínas provenientes de la primera extracción con 1-propanol y ácido acético se liofilizaron para realizar la electroforesis.

Reactivos utilizados

 Buffer de electrodo o de corrida 5X: Tris base 0,125 M con glicina 0,96 M y SDS 0,5%, pH = 8,3.

 Buffer separador 4X: Tris base 1,5 M, SDS 0,4%, pH 8,8  Solución de Acrilamida/Bis acrilamida 30,8%

 TEMED (N, N, N´,N´, -tetrametiletilendiamina) 0,4%  Persulfato de amonio 10%

 Buffer de muestra 4X: Tris base 0,37 M, glicerol 25% p/v, SDS 4,0% p/v y azul de bromofenol 0,1% p/v

 Buffer stacking 4X: Tris base 0,5 M, SDS 0,4%, pH 6,8 buffer apilador

 El colorante fue preparado disolviendo 1,92 g de Coomasie Blue R- 250 en 400 ml de alcohol metílico, 440 ml de agua destilada y 160 ml de ácido acético.

 El decolorante utilizado tuvo la siguiente composición: 650 ml de agua, 100 ml de ácido acético y 250 ml de etanol.

 Patrones de baja masa Molecular: fosforilasa b (97 kDa), albúmina (66 kDa), ovoalbúmina (45 kDa), anhidrasa carbónica (30 kDa), inhibidor de tripsina (20,1 kDa) y α- lactoalbúmina (14,4 kDa) (GE Healthcare, Inglaterra), los que se prepararon disolviéndolos en 200 µl de buffer de muestra con β-mercaptoetanol. (Pharmacia, Biotech, Estados Unidos).

Protocolo

Las electroforesis se llevaron a cabo en mini placas utilizando el equipo Mini-Protean III (BIO-RAD, Inglaterra). Se utilizaron geles de 1 mm de espesor con 10 calles cada uno, en los cuales el gel separador tuvo una concentración de acrilamida/bisacrialmida del 12% y el gel apilador o concentrador del 4%. Las fracciones proteicas liofilizadas fueron resuspendidas en el buffer de muestra (dos horas a 60 °C). El volumen de muestra sembrado por calle fue de 15 - 20 µl mientras que el volumen sembrado para el patrón fue de 4 µl. Las corridas se realizaron a corriente constante (30 mA/gel) durante el tiempo necesario. Luego los geles se fijaron y tiñeron con solución de Coomassie Blue R-250 y posteriormente se decoloraron. También se les realizó tinción con plata para obtener una mayor resolución.

Los geles fueron fotografiados empleando una cámara fotográfica Nikon 3000 y se realizó el análisis de las masas moleculares de las bandas con el empleo del programa Sigma Gel versión 1.0 (Jandel Scientific, Estados Unidos).

2.2.8.3.2. Estructura secundaria de proteínas de gluten

El efecto de las sales de calcio y la inulina sobre los cambios en la estructura secundaria de las proteínas de gluten se analizó por espectroscopia infrarrojo. Las

masas fueron preparadas según se describió en la sección 2.2.4 y fueron congeladas a -80 ºC, liofilizadas y molidas. Los espectros infrarrojo de las distintas muestras sólidas fueron medidos en un espectrofotómetro FTIR Brüker (Alemania) IFS 66. Para la cuantización de las muestras, los espectros fueron determinados por triplicado manteniendo la proporción de 49,54% de muestra en relación a KBr. La resolución espectral fue de ± 6 cm-1 y se realizaron 1000 scans de barrido. La determinación de la estructura secundaria de la proteína se llevó a cabo sobre la base del procedimiento descrito por Byler y Susi (1986) analizando la región entre 1580-1780 cm-1 con la finalidad de analizar la banda amida I. Las frecuencias, el número de picos, el ancho de los mismos a utilizar en el procedimiento de ajuste interactivo se obtuvieron analizando la segunda derivada. Las áreas de las bandas fueron calculadas por integración de la banda de Amida I. El procedimiento de ajuste de la curva se llevó a cabo asumiendo una mezcla inicial de funciones Lorentzianas y Gaussianas (FWHH de 13 a 18 cm-1) con un factor de resolución máximo. Correcciones de la línea de base, procedimiento de normalización, derivación, ajuste de curvas y cálculo del área se llevaron a cabo por medio de los programas Grams/32 (Galactic Industries Corporation) y OPUS.