Captación de hierro mediada por sideróforos

Los sideróforos (del griego sideros phoros “portadores de hierro”) son moléculas de bajo peso molecular sintetizadas por bacterias, levaduras y hongos que actúan como agentes quelantes específicos para el Fe+3 y cuya síntesis se ve normalmente estimulada cuando el microorganismo se encuentra en un entorno pobre en este elemento. Se definen como moléculas de pequeño tamaño que se sintetizan siguiendo rutas metabólicas sencillas. Poseen cadenas laterales y grupos funcionales que dan lugar a un conjunto de ligandos de alta afinidad que forman complejos de coordinación con los iones Fe+3. La característica principal de este tipo de moléculas es su elevada constante de disociación del hierro, oscilando entre 1022 y 1055. Esta alta afinidad, además de facilitar la captación de hierro a partir de compuestos insolubles como el hidróxido férrico, también permite liberar los átomos de hierro unidos a proteínas como la transferrina o la ferritina (Neilands, 1995). Pese a todo, los sideróforos no son capaces de obtener el hierro a partir del grupo hemo asociado a proteínas.

Durante el proceso infectivo la escasez inicial de hierro induce la producción y liberación extracelular de sideróforos. De este modo se inicia la captura del hierro para que la bacteria pueda disponer de él. Una vez que las necesidades del microorganismo están cubiertas disminuye la necesidad por el metal, por lo que se bloquea la síntesis de las

moléculas quelantes y se pone de manifiesto la gran sensibilidad del microorganismo ante las variaciones de los niveles intracelulares de hierro.

Actualmente están caracterizados unos 500 sideróforos (Fig. I-2). Su ruta biosintética está interconectada con el metabolismo aeróbico ya que se utiliza el oxígeno molecular activado por mono-, di- y N-oxigenasas. También participan ácidos derivados de la oxidación final del ciclo del ácido cítrico, tales como citrato, succinato y acetato. La mayor parte de los sideróforos se sintetizan a través de péptido-sintetasas no-ribosómicas (NRPS) (Butterton et al., 2000; Crosa y Walsh, 2002). Estos enzimas NRPS se identificaron originariamente en bacterias Gram-positivas como catalizadores de la síntesis de antibióticos y otras sustancias. Se trata de enzimas multimodulares que forman enlaces peptídicos entre aminoácidos cuando éstos se hallan unidos al complejo mediante enlaces tioéster y sin la participación de una molécula de RNA. Estos complejos multienzimáticos forman líneas de ensamblaje multimodulares. Los módulos a su vez constan de regiones catalíticas que constituyen dominios funcionales implicados en la selección y activación de monómeros, la elongación y, finalmente, la terminación de la cadena peptídica. Cada uno de estos módulos se diferencia según su posición dentro de la cadena de ensamblaje y su composición en los dominios catalíticos (Quadri, 2000). enterobactina vibriobactina pioverdina micobactina T Ferricromo anguibactina Aerobactina enterobactina vibriobactina pioverdina micobactina T Ferricromo anguibactina Aerobactina

Figura I-2: Estructuras de distintos sideróforos bacterianos: enterobactina, ferricromo y aerobactina de E. coli, vibriobactina de V. cholerae; micobactina T de M. tuberculosis; pioverdina de P. aeruginosa;

Normalmente los sideróforos utilizan uno o más de los grupos de unión al Fe+3 descritos a continuación (Crosa y Walsh, 2002; Winkelmann, 2002):

1. Ácido 2,3-dihidroxibenzoico (catecol) o ácido salicílico unido a un aminoácido. 2. Grupos hidroxamatos conteniendo el N5-acil-N5-hidroxiornitina o N6-acil-N6-

hidroxilisina.

3. Hidroxicarboxilatos formados a partir de ácido cítrico o ácido β-hidroxiaspártico. Pese a las diferencias químicas que puedan existir entre estas moléculas, se ha comprobado como algunas bacterias son capaces de utilizar no sólo sus propios sideróforos sino también los producidos por otras especies bacterianas e incluso por hongos (Bullen y Griffiths, 1999; Winkelmann, 2002).

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La utilización de sideróforos como agentes quelantes de hierro es un proceso cíclico que se inicia con su ensamblaje en el citoplasma celular. Tras su secreción al medio externo, a través de transportadores específicos, la molécula entra en contacto con el átomo de hierro dando lugar a la formación del complejo de coordinación con el ión Fe+3 (Boukhalfa y Crumbliss, 2002) (Fig. I-3). A continuación el complejo Fe-sideróforo es nuevamente transportado hacia el interior celular. En el caso de las bacterias Gram-negativas, éstas utilizan receptores específicos localizados en la membrana externa. A través de un proceso dirigido por el potencial de membrana citosólica y mediado por el sistema de transducción de energía TonB-ExbB-ExbD, el complejo Fe-sideróforo se transporta desde el exterior hasta el espacio periplásmico. Finalmente proteínas periplásmicas de unión facilitan un nuevo transporte hasta un sistema transportador ABC (ATP-Binding Cassette) ubicado en la membrana

Figura I-3. Grupos funcionales de unión a metal de los sideróforos y los complejos que forman con el ion

férrico. (1) Grupo ligando hidroxamato; (2) Grupo ligando catecolato; (3) Grupo ligando hidroxicarboxilato.

citoplasmática y que permite el paso hasta el citosol (Andrews et al., 2003; Köster, 2001) (Fig. I-4). Una vez en el interior celular, se supone una disociación del complejo por reducción del Fe+3, quedando este último disponible para su incorporación al metabolismo microbiano (Clarke et al., 2001). Por otro lado, las bacterias Gram-positivas, al carecer de membrana externa, no necesitan ni receptores de membrana externa ni un sistema TonB- ExbB-ExbD de transducción de energía. El paso del complejo Fe-sideróforo a través de su membrana citosólica está mediado por permeasas asociadas a un sistema transportador ABC análogo al descrito para las bacterias Gram-negativas. Sustituyendo a la proteína de transporte periplásmica, en estos casos existe una proteína de unión específica, generalmente una lipoproteína anclada a la superficie externa de la membrana plasmática.

Es posible que, una vez que ha tenido lugar la disociación del átomo de hierro, el sideróforo pueda ser reciclado y exportado nuevamente al exterior. De este modo se iniciaría un nuevo ciclo de captación manteniendo un nivel de adquisición de hierro constante y sin necesidad de sintetizar nuevas moléculas (Ratledge y Dover, 2000).

Todo el sistema, tanto de síntesis como de transporte,incluye el producto de múltiples genes que, normalmente, se asocian formando clusters génicos. Así en el caso del sideróforo vibrioferrina, producido por V. parahaemolyticus, y anguibactina, producido por V.

Figura I-4: Ciclo de utilización de sideróforos. Tras la entrada del complejo Fe-sideróforo hasta el interior

celular el Fe+3 _{se libera de manera que la molécula quelante puede ser secretada de nuevo para iniciar un}

nuevo ciclo de captación de Fe. (PP) proteína de unión periplásmica; Las proteínas PC (Proteína canal) y PA (Proteína ATPasa) constituyen el sistema de transporte ABC.

PP ATP Membrana externa Membrana interna PC PC PA AT_P PA TonB exbB Fe+3 Fe+3 _Fe+3 Fe+3 Fe+2 Fe+2 Receptor Fe+2 Fe+2 exbD PP ATP Membrana externa Membrana interna PC PC PA AT_P PA TonB TonB exbB Fe+3 Fe+3 _Fe+3 Fe+3 Fe+2 Fe+2 Receptor Fe+2 Fe+2 exbD sideróforo

región de DNA (Di Lorenzo et al., 2003; Tanabe et al., 2003). Sin embargo en otros casos, como el sideróforo vibriobactina sintetizado por V. cholerae, ambos tipos de genes se localizan en regiones génicas separadas (Wyckoff et al., 1997; 1999).

Durante los últimos años V. anguillarum, y más concretamente la cepa 775 del serotipo O1, ha constituido uno de los principales modelos de estudio en lo referente a los mecanismos de obtención de hierro a través de la producción de sideróforos. Las proteínas implicadas en la biosíntesis del sideróforo anguibactina, así como su correspondiente sistema de transporte, están codificadas en el plásmido de virulencia pJM1 (Di Lorenzo et al., 2003). Estudios mutacionales llevados a cabo en V. cholerae o V. vulnificus confirman la importancia de los sideróforos en la obtención eficaz de hierro in vivo y su relación directa con la virulencia de la cepa (Henderson y Payne, 1994a; Litwin et al., 1996; Webster y Litwin, 2000).

Dentro del género Vibrio se ha caracterizado un gran número de sideróforos de estructuras diferentes. Así V. cholerae, V. vulnificus y V. fluvialis se caracterizan por producir sideróforos de tipo catecol (vibriobactina, vulnibactina y fluvibactina respectivamente). Por otro lado, la anguibactina de V. anguillarum se considera de tipo catecol-tiazolin- hidroxamato, mientras que en otras especies marinas de vibrios se ha detectado la producción de aerobactina, un sideróforo de tipo hidroxamato derivado del citrato. Asimismo, también se ha detectado el sideróforo ferrioxamina G y, recientemente, en el patógeno de peces Vibrio salmonicida se ha identificado el hidroxamato denominado bisucaberina (Winkelmann, 2002). Esta amplia gama de sideróforos estructuralmente diferentes dentro de la familia Vibrionaceae podría ser reflejo del gran número de genes implicados en la biosíntesis de estas moléculas. En el caso de otras bacterias marinas como Alteromonas, Halomonas y Marinobacter, también se ha descrito la síntesis y utilización de sideróforos, lo que da idea de la importancia de este mecanismo en la obtención de hierro también dentro del ambiente marino (Winkelmann, 2002).