III- MATERIAL Y MÉTODOS
10. Primer Extension
Esta técnica permite la identificación del punto de inicio de la transcripción de un determinado gen a partir de la síntesis del cDNA correspondiente a su mRNA. Para ello se utiliza un oligonucleótido específico, marcado previamente con 32P, y homólogo a la
secuencia próxima al extremo 5’ de dicho RNA. Tras el análisis electroforético del producto de la reacción de reverso-transcripción se estima el tamaño de dicha molécula de cDNA, pudiendo deducir la posición +1 a partir de la cual se inicia el proceso de síntesis del RNA.
Se siguió básicamente el protocolo descrito por Delany et al. (2001). Para el análisis de las regiones promotoras de los genes huvA y huvX se diseñaron cebadores localizados aproximadamente a 50 pb y a 100 pb “corriente abajo” del ATG inicial del gen a estudiar. En el caso del gen tonB1 y del gen huvB sólo se utilizó un cebador situado aproximadamente a 100 y 50 pb, respectivamente, del punto de inicio de la traducción. Estos mismos cebadores se utilizaron en las reacciones de secuenciación que sirvieron como marcadores de peso molecular. Por otra parte el RNA empleado en los ensayos se purificó a partir de cultivos de la cepa H775-3 de V. anguillarum, crecida en medio mínimo CM9 y en medio mínimo en presencia de un exceso de hierro (FAC 4 μg/ml).
1) Marcaje de la sonda: Cada oligonucleótido (75 pmol) se marcó en su extremo 5’ con 10 U del enzima T4 polinucleótido kinasa (Roche) y en presencia de 120x106 μci (γ-32P)- dATP (6.000 Ci/mmol, Perkin Elmer) a un volumen final de 10 μl. La reacción se incubó a una temperatura de 37 ºC durante 30 min. Para eliminar los restos de isótopo no unido a la sonda las reacciones se limpiaron con el sistema QIAquick Nucleotide Removal kit (Qiagen).
1’ 95 ºC 3’ 1’ 1’ 5’ x30 95 ºC 50 ºC 72 ºC 72 ºC
El DNA marcado se resuspendió en 150 μl de agua desionizada estéril.
2) Hibridación y primer extension: La reacción de hibridación RNA:sonda se llevó a cabo en un volumen final de 13 μl, en los que se mezclaron 10 μg de RNA total con, aproximadamente, 106 cpm de la sonda marcada y dNTPs 10 mM. La mezcla de reacción se desnaturalizó a 95 ºC durante 5 min y se dejó enfriar a 25 ºC/10 min. La reacción de primer extension se inició añadiendo a la mezcla anterior 2 μl de DTT 0,1 M y 4 μl de tampón de reacción (Tris-HCl 250 mM, pH 8,3; KCl 375 mM; MgCl2 15 mM). Tras una incubación de 2
min a 42 ºC, la reacción se completó con 200 U del enzima SuperScriptTM II Reverse
Transcriptase (Invitrogen) y se continuó la incubación a 42 ºC/40 min.
Una vez finalizada la síntesis del cDNA, la reacción se llevó hasta un volumen final de 50 μl con agua desionizada y se extrajo una vez con fenol:cloroformo (1:1). El cDNA se recuperó precipitando con 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M (pH 5,2) y 2 volúmenes de etanol a -20 ºC. Finalmente se resuspendió en 4 μl de agua + 4 μl de tampón de carga (formamida 95%; EDTA 20 mM; azul de bromofenol 0,05%; xylene cyanol FF 0,05%).
3) Secuenciación: Simultáneamente se procedió a secuenciar la región de DNA con los mismos cebadores empleados en las reacciones de primer extension. Se siguió el método de terminación de cadena dideoxi con el sistema DNA Sequenase kit Version 2.0 (U.S. Biochemical Corp.) y [α-S35]dATP como isótopo radioactivo (6.000 ci/mmol, Perkin Elmer). Entre 0,5 y 3 μg de DNA genómico se mezclaron con 2 μl de tampón de reacción (Tris-HCl 200 mM, pH 7,5; MgCl2 100 mM; NaCl 250 mM), 0,5 pmol del cebador y agua hasta un
volumen final de 10 μl. La reacción se calentó a 65 ºC durante 2 min y a continuación se incubó durante 15-30 min a 35 ºC. Tras enfriar la mezcla en hielo, se añadió 1 μl de DTT 0,1 M, 2 μl de una dilución 1:5 de la mezcla de marcaje (7,5 μM dGTP; 7,5 μM dCTP; 7,5 μM dTTP), 0,5 μl de [α-S35]dATP (1250 Ci/mmol) y 2 μl de secuenasa T7. La reacción se incubó 5 min a temperatura ambiente. Finalmente se transfirieron 4,5 μl a cada uno de los tubos de terminación con 2,5 μl del ddNTP correspondiente (8 μM) y calentados previamente a 37 ºC. Tras seguir la incubación a 37 ºC durante otros 5 min, la reacción se paró añadiendo 4 μl del tampón de carga descrito en el apartado anterior.
4) Electroforesis: Los productos secuenciados y los fragmentos de cDNA obtenidos tras la reacción de reverso-transcripción se sometieron a electroforesis en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 6% (acrilamida:bis-acrilamida 19:1 (Biorad); Urea 7 M) y 0,2 mm de espesor. Tras la polimerización el gel se sometió a una electroforesis previa en
tampón TBE (Tris base 90 mM; ácido bórico 89 mM; EDTA 1 mM) durante 1 h a 800 V y manteniendo una temperatura constante de 50 ºC. Las reacciones de secuenciación y de primer extension se desnaturalizaron a 90 ºC durante 3 min cargando en el gel entre 2 y 3 μl. La electroforesis se llevó a cabo a 2.000 V y a 50 ºC de temperatura. Finalmente el gel se desecó a 80 ºC durante 2 h (583 Gel Drying System, Biorad) y se expuso entre 12-16 h empleando una película de autorradiografía (Hyperfilm MP, Amersham Pharmacia-Biotech) a -80 ºC (HypercassetteTM, Amersham Pharmacia-Biotech).
11. FUSIONES TRANSCRIPCIONALES Y ENSAYOS DE ACTIVIDAD β- GALACTOSIDASA
El plásmido de bajo número de copias pHRP309 (Parales y Harwood, 1993), específico para la construcción de fusiones transcripcionales, se caracteriza por incluir el gen lacZ sin un promotor que regule su expresión (Fig. III-8). La clonación de una secuencia con actividad promotora dentro de la región localizada “corriente arriba” de este gen implica que su transcripción y síntesis queda bajo el control del inserto clonado. Los niveles de actividad β-galactosidasa, producto de la expresión del gen lacZ, estarán directamente relacionados con los niveles de transcripción, determinados a su vez por el promotor asociado al gen. La detección de los niveles de actividad promotora se basa en la utilización del ortonitrofenil β- D-galactopiranósido (ONPG), molécula estructuralmente similar a la lactosa y en la que la glucosa es sustituida por un grupo ortonitrofenilo. La hidrólisis del ONPG por acción del enzima β-galactosidasa implica la liberación del cromóforo ortonitrofenilo que es fácilmente detectable, por el cambio de coloración del medio a amarillo, y cuantificable por espectrofotometría.
Para la construcción de las fusiones promotor::lacZ, las secuencias promotoras se obtuvieron mediante amplificación por PCR. Los cebadores utilizados para la amplificación de la región promotora correspondiente al gen huvA fueron FT-huvA1/FT-huvA2, para el promotor de huvX se utilizaron los cebadores FT-huvXZ1-FT-huvXZ2 y para la amplificación del promotor adyacente al gen tonB los cebadores FT-tonB1/FT-tonB2. Finalmente se emplearon los cebadores FT-huvBCD1 y FT-huvBCD2 para amplificar y clonar la región intergénica exbD1-huvB. En el extremo 5´ de cada par de cebadores se incluyeron dianas de restricción para facilitar su posterior clonación. La secuencia correspondiente a cada uno de
estos cebadores se muestra en el Anexo II. Las condiciones de PCR empleadas en todas las amplificaciones fueron las siguientes:
Inicialmente los productos de amplificación, de un tamaño aproximado de 400 pb, se clonaron en el plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Los insertos se liberaron por digestión con KpnI-EcoRI y se subclonaron en el plásmido pHRP309. Las construcciones resultantes (phuvA::lacZ, phuvX::lacZ y ptonB1::lacZ) se transfirieron por conjugación desde la cepa S17-1-λpir de E. coli a las cepas de V. anguillarum H775-3, 775met11, B106, B219 y B228. Los clones transformados se seleccionaron en base a su resistencia al antibiótico Gm (marcador del pHRP309) y a la Rif (marcador de resistencia para la cepa 775met11) o a la Amp (marcador para el resto de cepas de V. anguillarum).
Para los ensayos de actividad transcripcional los niveles de β-galactosidasa se determinaron siguiendo el método de Miller (1992). Cada una de las cepas de V. anguillarum transformada con el plásmido de fusión se ensayó en medio mínimo CM9 bajo distintas condiciones de disponibilidad y fuentes de hierro. Dichas condiciones fueron las siguientes: Fe2(SO4)3 40 μM; EDDA 1,5 μM; EDDA 1 μM; Hemina 10 μM + EDDA 5 μM;
Protoporfirina IX 10 μM. 1’ 95 ºC 3’ 1’ 1’ 5’ x30 95 ºC 65 ºC 72 ºC 72 ºC
Figura III-8: Mapa del plásmido
pHRP309 específico para el ensayo de fusiones transcripcionales. MCS, punto de clonación. lacZ Gm oriV oriT rep ScaI EcoRV BgIII SacII PstI NotI ClaI EcoRV SacI ScaI HindIII NotI EcoRV ScaI XmnI MCS pHRP309 12.0 kb PstI SalI XbaI BamHI KpnI SmaI MCS BamHI SmaI EcoRI lacZ Gm oriV oriT rep ScaI EcoRV BgIII SacII PstI NotI ClaI EcoRV SacI ScaI HindIII NotI EcoRV ScaI XmnI MCS pHRP309 12.0 kb PstI SalI XbaI BamHI KpnI SmaI MCS BamHI SmaI EcoRI PstI SalI XbaI BamHI KpnI SmaI MCS BamHI SmaI EcoRI
Las células se incubaron en medio líquido CM9 a 25 ºC hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm entre 0,3 y 0,4. De cada cultivo se hicieron dos ensayos con 0,1 y 0,3 ml respectivamente. Ambos se llevaron hasta un volumen final de 1 ml con tampón Z (Na2HPO4·2H2O 60 mM; NaH2PO4·H2O 40 mM; KCl 10 mM; MgSO4·7H2O 1 mM; β-
mercaptoethanol 50 mM; pH 7,0). Tras añadir 20 μl de cloroformo y 10 μl de una disolución de SDS al 0,1%, la mezcla se incubó a 37 ºC durante 5 min. La reacción se inició añadiendo 0,2 ml del compuesto ONPG (4 mg/ml en tampón Z). Cuando la reacción cambió su color a amarillo, ésta se bloqueó con 0,5 ml de Na2CO3 1 M. Finalmente la actividad promotora se
cuantificó en Unidades de β-galactosidasa midiendo la absorbancia a 420 nm y aplicando la siguiente fórmula:
DO600: densidad celular del cultivo justo antes del ensayo (600 nm) DO420: lectura de la mezcla de reacción a 420 nm
T: tiempo de la reacción (min)
V: volumen del cultivo ensayado (ml)
Los ensayos se repitieron un mínimo de tres veces de manera independiente y las medias de los resultados obtenidos así como los índices de error derivados del experimento se calcularon con el programa de análisis de datos Microsoft EXCEL (Microsoft Office).
12. CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) DE QUELANTES DE