Características bioquímicas de la apoptosis

Gran parte de los conocimientos que se disponen actualmente sobre las moléculas que intervienen en la apoptosis de los vertebrados deriva de los estudios genéticos realizados en el nemátodo Caenorhabditis elegans. Tres productos génicos de C.elegans son esenciales para la regulación de la apoptosis: CED-3 y CED-4, los cuales promueven la apoptosis y CED-9, un inhibidor de la misma (Hengartner y Horvitz, 1994). Los vertebrados han desarrollado familias enteras de proteínas que simulan a los genes apoptóticos de C. elegans. Las caspasas de los mamíferos son similares a CED-3 (Thornberry y Lazebnik, 1998). Apaf-1 es el único homólogo de CED-4 conocido hasta el momento en mamíferos (Zou y col., 1997). Los productos de la familia de genes Bcl-2 están relacionados con CED-9, pero incluyen dos subgrupos

Estímulo Apoptótico

Estímulo Necrótico

de proteínas, las cuales tanto inhiben como promueven la apoptosis (Adams y Cory, 1998; Yang y Korsmeyer, 1996).

4.2.1. Caspasas

Las caspasas son una familia de proteasas que cortan específicamente tras un residuo de aspártico. Reconocen un motivo de al menos cuatro aminoácidos situado antes del punto de corte. El motivo tetrapeptídico preferido para cada caspasa difiere entre ellas y esto explica la diversidad de sus funciones biológicas (Thornberry y col., 1997).

Las caspasas mantienen similitudes entre ellas a nivel de su secuencia aminoacídica, estructura y especificidad para el substrato (Nicholson and Thornberry, 1997). Todas ellas están constitutivamente presentes en muchas células, residiendo en el citosol como proenzimas de cadena simple (de 30 a 50 kDa) que contienen tres dominios: un dominio N-terminal (pro-dominio), un dominio que dará lugar a una subunidad grande (20 kDa) y un tercer dominio correspondiente a una subunidad pequeña (10 kDa). Su activación se debe al procesamiento proteolítico de estos dominios, seguido por la asociación de las subunidades grande y pequeña para formar un heterodímero (Fig. 13). A continuación, dos de estos heterodímeros se asocian para formar un tetrámero, con dos sitios catalíticos que funcionan de forma independiente (Rotonda y col., 1996; Walker y col., 1994; Wilson y col., 1994). Dentro de cada dominio catalítico, la subunidad grande y la pequeña se encuentran íntimamente asociadas, contribuyendo ambas a la unión del sustrato y de su catálisis posterior.

La cascada de activación de la apoptosis empieza por las caspasas iniciadoras. Son caspasas con grandes pro-dominios y con regiones de interacción interproteica que se activan a sí mismas por autoproteolisis. Por ejemplo, la agregación de varias moléculas de pro-caspasa 8 es suficiente para permitir la autoproteolisis y activación de esta caspasa (Muzio y col., 1998a; Yang y col., 1998). Los efectos de la activación de las caspasas iniciadoras se ven amplificados por la

proteolisis y activación de otras caspasas con pro-dominios cortos y sin motivos de interacción interproteicos (caspasas 3, 6, 7) situadas por debajo de la vía de señalización de la apoptosis y que reciben el nombre de caspasas efectoras. Existen dos rutas distintas de activación de las caspasas. La vía dependiente de receptores de la membrana celular (death receptors) y aquella derivada de la liberación de citocromo C por parte de la mitocondria en la que intervienen la familia de proteínas Bcl-2 (apartado 4.2.3).

Figura 13. Función y estructura de la familia de las caspasas.

Hasta la fecha se han identificado 13 caspasas distintas en mamíferos (las caspasas 11 y 12 pertenecen a ratón y todavía se desconoce su homólogo humano). Las funciones de las caspasas se han deducido a partir de experimentos con ratones

knock-out (Thornberry y Lazebnik,

1998).

La activación de las caspasas y la proteolisis de sus dianas específicas son los responsables últimos de todas las modificaciones morfológicas y bioquímicas que se observan en la célula que sufre apoptosis. Entro los substratos de las caspasas encontramos a ICAD/DFF45, un inhibidor de la nucleasa responsable de la fragmentación del DNA, (CAD, caspase-activated deoxyribonuclease) (Liu y col., 1997); componentes estructurales como la lámina nuclear (Orth y col., 1996; Takahashi y col., 1996), o proteínas implicadas en la regulación del citoesqueleto, incluyendo a la gelsolina (Kothakota y col., 1997), la FAK (focal adhesion kinase)

Caspasa 12 Caspasa 11 Caspasa 13 Caspasa 4 Caspasa 5 Caspasa 1 Caspasa 2 Caspasa 9 Caspasa 8 Caspasa 5 Caspasa 3 Caspasa 7 Caspasa 10 Inflamación Inflamación Inic/Efect Iniciadora Iniciadora Efectora Efectora Efectora Iniciadora Homología Función Otras Apoptosis Asp Asp

PRO-DOMINIO GRANDE PEQUEÑA

(Wen y col., 1997) o la PAK-2 (p21-activated kinase 2) (Rudel y Bokoch, 1997); o de la membrana plasmática la cual pierde la asimetría en la distribución de los fosfolípidos debido a un fallo en la enzima dependiente de ATP que, en condiciones normales, transporta los fosfolípidos cargados negativamente hacia el interior celular (Fadok y col., 1992). Además, las caspasas inactivan algunas proteínas implicadas en la reparación del DNA, como la proteína DNA-quinasa (DNA-PK), proteínas implicadas en el procesamiento de los mRNA (como la U1-70K) o en la replicación del DNA (como el factor de replicación C) (Cryns y Yuan, 1998).

4.2.2. Death Receptors

En los mamíferos, una de las vías de actuación de las caspasas es inducida tras la activación de algunos receptores de membrana de la familia del receptor del TNF-α (TNFR). Las proteínas implicadas en esta vía presentan dos tipos de dominios de interacción entre proteínas: el “death domain” (DD) y el “death efector domain” (DED). El DD se ha encontrado en la región intracelular de algunos receptores de la familia del TNFR, concretamente en CD95 (también denominado Fas o Apo-1) y en CD10a (TNFR1, el receptor p55 de TNF-α). También se ha descrito en algunas proteínas adaptadoras citoplasmáticas, como FADD, TRADD o RIP, las cuales, a través de este dominio, interaccionan tanto con los receptores activados como entre ellas mismas. Por su parte, el motivo DED se encuentra también en algunas de dichas proteínas adaptadoras y en las caspasas 8 y 10. La unión de estas caspasas a las proteínas adaptadoras a través de las regiones DED tiene lugar tras la activación de los receptores de la familia del TNFR, y supone el autoprocesamiento de las caspasas, su activación y, por lo tanto, la inducción de apoptosis (Fig. 14).

Por tanto, la vía de inducción de apoptosis a través de los receptores de la familia del TNFR (death receptors) es una vía muy rápida y de escasa sofisticación basada en el reclutamiento de moléculas adaptadoras mediante sus dominios DD o DED, cuya única función es aproximar y activar a una caspasa iniciadora, como la caspasa 8. Sin embargo, estos receptores a su vez son capaces de transmitir otras

vías de señalización más complejas, las cuales pueden ser tanto activadoras como inhibidoras de la apoptosis dependiendo del tipo celular, y que incluyen a vías o proteínas de la familia de JNK o IKK, y donde intervienen proteínas adaptadoras de la familia TRAF (Beg y Baltimore, 1996; Chinnaiyan y col., 1995; Hsu y col., 1996) (Fig. 14).

Figura 14. Señalización inducida por el

receptor del TNF-α . TRADD, TNFα

receptor-associated death domain; DD,

death domain; FADD, Fas-associated

death domain; RIP, receptor-interacting protein; NIK, NF-κB inducing kinase; IKK,

IκB kinase complex; IκB, inhibitor of k B;

NFκB, nuclear factor kB; JNKK, JNK

kinase; JNK, c-Jun kinase.

4.2.3. Familia de proteínas Bcl-2

La secuenciación del gen ced-9 en C. elegans reveló que se trataba de un homólogo estructural y funcional del proto-oncogén humano bcl-2 (Hengartner y Horvitz, 1994). En mamíferos existe toda una familia de proteínas homólogas al proto- oncogén Bcl-2 (Chao y Korsmeyer, 1998; Cory, 1995). Todos los miembros de esta familia poseen entre uno y cuatro motivos conservados, denominados dominios

DD DD DD TRADD F A D D Caspasa 8 Caspasa efectora APOPTOSIS TRADD R I P TRAF2 cIAP 1/2 NIK IKK IκκB/NFκ κB N Fκ κB MEKK J N K K JNK

homólogos a Bcl-2 (BH1-BH4). Estas proteínas se pueden clasificar en dos categorías funcionales: unas con capacidad para inhibir la apoptosis (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, A1) y otras con capacidad para promoverla (Bax, Bak, Bik1, Bad y Bcl-XS) (revisado en Yang y Korsmeyer, 1996).

Bcl-2 y sus homólogos anti-apoptóticos ejercen funciones clave durante el proceso apoptótico en vertebrados. Por una parte, pueden formar canales que permiten el transporte de iones y proteínas a través de las membranas intracelulares, preferentemente en el retículo endoplasmático, en la membrana nuclear (Minn y col., 1997; Reed, 1997; Schendel y col., 1997) y en la membrana mitocondrial externa, donde, por ejemplo, controlan la liberación del citocromo C (Kluck y col., 1997; Yang y col., 1997a). Por otra parte, actúan como proteínas adaptadoras, siendo capaces de interaccionar con al menos once proteínas diferentes, entre ellas Raf-1 (Wang y col., 1994; 1996), Apaf-1, una proteína que colabora en la activación de las caspasa de manera análoga a lo que ocurre en C.elegans entre CED-9 y CED-4 (Hengartner, 1997; Vaux, 1997) y componentes de su propia familia. En este sentido, los miembros de la familia Bcl-2 pueden formar homodímeros y heterodímeros, existiendo una relación antagónica entre las dos categorías de componentes de la familia. En muchas situaciones el destino final de la célula está determinado por la relación entre los niveles de los componentes promotores de apoptosis y los componentes inhibidores de la misma (Antonsson y col., 1997; Boise y col., 1993; Gajewski y Thompson, 1996; Oltvai y col., 1993; Reed, 1997; Sato y col., 1994; Sedlack y col., 1995; Yang y col., 1995).