Características de las estirpes de SMG donde se han encontrado

4.2.1. Curvas de crecimiento y características fenotípicas de S. infantis SK970, S.

mitis SK597, S. mitis SK1073, S. oralis SK313 y S. oralis ATCC 49296

Como ya se ha mencionado anteriormente, S. pneumoniae y algunos SMG presen- tan una lisis característica durante la fase estacionaria que es debida a la acción de su principal autolisina, LytA. La actividad de las CBPs se ve inhibida cuando el me- dio de cultivo se suplementa con cloruro de colina al 2%, de tal manera que no sólo no se produce la lisis sino que, además, se forman cadenas celulares debido a que la actividad de LytB (u otras proteínas similares) también se encuentra inhibida. Con el fin de detectar la expresión y actividad de la proteína LytA, principalmente, estas cepas de SMG se incubaron tanto en medio C+Y como en C+Y al que se añadió cloruro de colina al 2% (C+Y+Cho). Se siguió el crecimiento durante 24 h (Fig. 20) observándose que todas las cepas, con excepción de S. infantis SK970, presenta- ban un tiempo de duplicación muy similar en ambos medios así como ausencia de lisis en la fase estacionaria. S. infantis SK970, sin embargo, sí se lisaba en la fase estacionaria cuando se incubaba en medio C+Y. Cuando las cepas cultivadas en C+Y se examinaron al microscopio (Fig. 21) se observaron diplococos y cadenas cortas (4−8 células), mientras que en C+Y+Cho, formaban cadenas largas (50−70 células), particularmente en el caso de S. infantis SK970 (140−180 células).

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Fig. 20. Curvas de crecimiento de las cepas de SMG en los medios de cultivo C+Y y C+Y+Cho.

A, S. oralis SK313; B, S. mitis SK597; C, S. infantis SK970; D, S. mitis SK1073; E, S. oralis ATCC 490296.

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Ya se ha comentado que, mientras que un cultivo de S. pneumoniae se lisa en presencia tanto de Doc al 1% como de Tritón−X100 al 1% debido a la acción de la proteína LytA de 318 aa, las estirpes de SMG que presentan proteínas LytA de 316 aa de tipo bacteriano, no lo hacen en presencia de Doc al 1% pero sí de Tri- tón−X100 al 1% o Doc al 0.1% (Díaz et al.,1992; Obregón et al., 2002; Balsalobre et

al., 2006; Llull et al., 2006). Por esta razón, se realizó un ensayo de susceptibilidad

de las bacterias a ambos detergentes (Tabla 20). S. infantis SK970, a pesar de po- seer un gen lytA de tipo fágico, se lisó tanto en presencia de Doc como de Tri- tón−X100 al 1% mientras que S. mitis SK597, que posee un gen lytA de tipo bacte- riano, no se lisó en presencia de ninguno de los dos detergentes. El resto de estir- pes, S. oralis SK313 y ATCC 49296 y S. mitis SK1073 (sus genes lytA son de tipo fágico), tampoco lo hicieron en presencia de ninguno de ellos.

4.2.2. Presencia de colina en la pared celular

Existen numerosos estudios que por medio de diferentes técnicas (inmunoensayos, estudios de incorporación de colina radiactiva a la pared celular, cromatografía y espectrometría, detección de los loci lic por PCR, etc.) han demostrado la presencia de colina en la pared celular de diferentes estreptococos como S. pneumoniae, S.

mitis y S. oralis (Kilpper−Bälz et al., 1985; Ronda et al., 1991; Gillespie et al., 1993;

Horne y Tomasz, 1993; Kolberg et al., 1997; García et al., 1998; Gmür et al., 1999; Bergström et al., 2000; Hakenbeck et al., 2009). Kilian et al. (2008) obtuvieron dos anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos característicos de la estructura del polisacárido C y residuos de fosforilcolina, respectivamente. Gracias a estos an- ticuerpos, estos autores detectaron la presencia de colina en todas las cepas anali- zadas de S. pneumoniae, S. pseudopneumoniae y S. oralis; también detectaron co- lina en la mayoría de las cepas de S. mitis (las que no presentaban colina presenta- ban el aminoalcohol etanolamina) y las cepas de S. infantis mostraban una presen- cia variable de los dos epítopos. Teniendo en cuenta lo expuesto anteriormente, se procedió a inspeccionar la presencia de colina en la pared celular de las cepas en estudio, determinando si la autolisina de R6 (LytAR6) era capaz de hidrolizar las pa-

redes de estas cepas ya que en el caso de que no hubiera colina en sus paredes la LytAR6 sería incapaz de hidrolizarlas. Para ello, se realizaron ensayos sobre cultivos

líquidos a los cuales se añadió proteína LytAR6 pura (10 g de LytAR6/ml de cultivo,

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realizó la prueba del Doc al 1% pudiéndose comprobar cómo todas las cepas se li- saban en presencia de Doc.

4.2.3. Inducción de fagos atemperados

Debido a que los genes lytA de las estirpes de estreptococos estudiadas en esta Tesis son mayoritariamente de tipo fágico, excepto en el caso de S. mitis SK597, se realizaron ensayos de inducción con mitomicina C con el fin de averiguar si estos genes formaban parte de profagos viables y su LytA era lo suficientemente activa como para provocar la lisis celular (Tabla 20). La curva de crecimiento característica de una cepa bajo condiciones de inducción de fagos atemperados consiste en un crecimiento de la cepa moderado (hasta una A550 de la mitad que en condiciones

normales, aproximadamente) y una lisis acentuada (total o casi total) del cultivo en la fase estacionaria. Se observó que S. oralis SK313, S. mitis SK597 y S. mitis SK1073 no se lisaban en presencia de mitomicina C, aunque sí presentaban un crecimiento más reducido que en condiciones normales (entre 25−40% menos de

A550 con respecto al control). Nótese que la LytASK597 era de tipo bacteriano y no fá-

gico. Sin embargo, en el caso de S. infantis SK970 y S. oralis ATCC 49296, la mi- tomicina C sí inducía la lisis. Romero et al. (2004a) describieron que las cepas de S.

mitis HER y B6 (poseen alelos de tipo fágico de 318 aa: lytA2_SPH y lytA3_SPH, respec-

tivamente) no se lisaban al final de la fase estacionaria salvo cuando se inducían sus profagos con mitomicina C. Asimismo, una vez inducidos los profagos, estas cepas se lisaban en presencia de Doc al 1%. Por este motivo, durante el ensayo de inducción de fagos atemperados, también se realizaron pruebas de lisis con Doc al 1% una hora y 2 h después de haber añadido mitomicina C. Únicamente se lisaron los cultivos con y sin mitomicina C de la cepa SK970 de S. infantis.

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Tabla 20. Lisis de las estirpes de SMG estudiadas en esta Tesis en diferentes condiciones de cultivo

a

Lisis en la fase estacionaria de un cultivo líquido en C+Y de cada una de las estirpes.

b

Lisis en la fase estacionaria de un cultivo líquido en C+Y+ 2% de cloruro de colina de cada una de las estirpes.

c _{Lisis en presencia de Doc al 1% de una muestra de cultivo líquido en C+Y de cada una de las estirpes.} d

Lisis en presencia de Tritón al 1% de una muestra de cultivo líquido en C+Y de cada una de las estir- pes.

e

Lisis, por inducción de fagos atemperados, de un cultivo líquido en C+Y+ mitomicina C de cada una de las estirpes.

f

Lisis en presencia de Doc al 1% de una muestra de cultivo líquido en C+Y+ mitomicina C de cada una de las estirpes.