Las endolisinas tipo LytA de los fagos atemperados de neumococo

Además de los alelos lytA de S. pneumoniae (lytASpn), todos los fagos atemperados de neumococo descritos hasta el momento poseen genes líticos (o endolisinas) homólogos al de su hospedador y que serán denominados en esta Tesis como ale- los lytAPPH. Los alelos lytA de tipo fágico se encuentran localizados inmediatamente

en posición 3’ del gen de la holina. Por ejemplo, los genes hbl (del fago HB−3) (Romero et al., 1990a, b), mml (del fago MM1) (Obregón et al., 2003a) o lytAVO1 (del

fago VO1) (Obregón et al., 2003b) (Tabla 4). Estos alelos lytAPPH codifican una pro-

teína de 318 aa, es decir, del mismo tamaño que la LytA bacteriana. Hay que des- tacar que estas enzimas líticas tipo LytA que presentan los profagos son muy simi- lares tanto entre sí (con una media de 91.5% de identidad) como cuando se compa- ran con la NAM-amidasa LytA de la bacteria hospedadora (68.3% de identidad) (Romero et al., 2009a). Es notable, sin embargo, que los fagos líticos (o virulentos) de neumococo conocidos (fago Dp-1 o familia de fagos Cp) y que, obviamente, también codifican enzimas líticas, éstas o son de la familia de las lisozimas (o mu- ramidasas; EC 3.2.1.17), como en el caso de los fagos Cp, o NAM-amidasas pero de una familia diferente (clasificada por Pfam como Amidase_5; PF05382) a la LytA de neumococo y sus profagos (véase más arriba). Sin embargo, resulta destacable el hecho de que la enzima lítica o endolisina del fago Dp-1 (Pal) (Sheehan et al., 1997) es muy similar (72% de identidad) a la codificada (Gp56) por el fago atempe- rado SM1 de S. mitis (Siboo et al., 2003). En muchas ocasiones, los fagos atempe- rados que se detectan en los diferentes aislados, no son viables sino que son fagos

INTRODUCCIÓN

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que han perdido parte de su genoma (fagos incompletos o defectivos) (Ramirez et

al., 1999; Romero et al., 2009b).

Tabla 4. PED (%) entre los diferentes tipos de alelos lytA.

PED, distancias evolutivas deducidas del alineamiento entre dos secuencias. lytASpn, alelos lytA de S. pneumoniae.

lytASMG, alelos lytA de SMG distintos de neumococo.

lytAPPH, alelos lytA de fagos atemperados de neumococo.

lytASPH, alelos lytA de fagos atemperados de SMG distintos de neumococo

Existen razones fisiológicas por las que el genoma de estos fagos presenta ge- nes tipo lytA. El sistema holina-endolisina constituye la principal estrategia adoptada por los bacteriófagos para lisar sus bacterias hospedadoras al final del ciclo infecti- vo con el fin de liberar la progenie fágica (Young, 2005). Mientras que las endolisi- nas (o lisinas), en el caso de los fagos de neumococo, se corresponden con las lisi- nas tipo LytA comentadas anteriormente (Romero et al., 1990a; Obregón et al., 2003a y b; Romero et al., 2009a), las holinas son proteínas con dominios trans- membrana que causan lesiones en la membrana citoplasmática del hospedador (Wang et al., 2000; Young, 2005). Recientemente, se ha demostrado que, al revés de lo que se creía, las holinas no representan un requerimiento absoluto para el transporte de las lisinas a la envuelta celular (São−José et al., 2000; Xu et al., 2004), mientras que sí son necesarias para la actividad de las mismas ya que disi- pan la fuerza protón motriz de la membrana. Debido a la gran similitud entre las en- dolisinas fágicas y la LytA neumocócica, se ha propuesto que también podrían compartir localización y mecanismos de control (Frias et al., 2013). Ambos tipos de proteínas carecen de péptido señal aparente así como de otras proteínas tanto en el genoma del virus como en el de la bacteria que pudieran estar implicadas en su

INTRODUCCIÓN

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transporte (Díaz et al., 1996; Martín et al., 1998; Obregón et al., 2003a; López y García, 2004; Frias et al., 2009). Se ha descrito que durante la biosíntesis de los TA, la colina se incorpora a los precursores de los mismos que pasan a través de membrana citoplasmática por un mecanismo biestable (o de flip−flop) y se incorpo- ran a la pared celular (Zhang et al., 1999; Damjanovic et al., 2007). Recientemente, se ha comprobado que la colina es crucial para la translocación de la lisina Svl del fago SV1 (Frias et al., 2013) y se ha especulado con que la lisina fágica se podría co−transportar a la pared celular junto con los TA. La LytA bacteriana se ha encon- trado preferentemente en el septo de la bacteria, donde se forma el peptidoglicano naciente (Díaz et al., 1989; Mellroth et al., 2012); sin embargo, no se conoce el me- canismo por el cual esta proteína se localiza ahí específicamente aunque, se ha do- cumentado que las nuevas cadenas de TA se incorporan a la pared celular por la zona del septo (Briles y Tomasz, 1970; Tomasz et al., 1971). La localización de LytA podría explicarse si su transporte estuviera asociado a la biosíntesis de los TA como se ha sugerido para las lisinas fágicas.

La disrupción de la fuerza protón motriz provocada por el efecto de la permeabi- lización causada por la holina en la membrana, dispararía la acción de la lisina (Frias et al., 2013). Sin embargo, se desconoce cómo la fuerza protón motriz estaría reprimiendo a la lisina fágica. Está comúnmente aceptado que la interacción con los LTA regula la actividad de la LytA (Höltje y Tomasz, 1975a; Briese y Hakenbeck, 1985), así como la de las lisinas fágicas (García et al., 1987b). Se ha sugerido que el potencial de membrana hace que los LTA muestren una conformación específica en la superficie de las bacterias Gram−positivas, de tal manera que variaciones en la fuerza iónica del medio podrían resultar en cambios conformacionales de los LTA (Neuhaus y Baddiley, 2003). La pérdida de fuerza protón motriz de la membrana provocada por las holinas induciría una reorganización química y estructural en la envuelta celular que podría anular la función inhibitoria de los LTA sobre las lisinas. Se sugiere que el transporte de TA podría contribuir también a un mecanismo de regulación de la lisina fágica ya que el transporte estaría asociado a su molécula reguladora (Frias et al., 2013).