Caracterització de l’efecte funcional del producte IDI3A

a identificació de hits in vitro requereix la confirmació dels resultats obtinguts empran

DI3A de competir la interacció RCAN- CnA mitjan

hibició del producte IDI3A vers la translocació nuclear de

iverses citoquines dependents de NFAT en pre

ial immunosupressor

cions, vam realitzar assaig dosi-resposta mitjançant anisotropia de fluorescència respecte les unions C18-RCAN3-CnA i SPRIEIT-CnA (Figura 36). En tots els casos el producte IDI3A desplaça específicament les interaccions analitzades.

% Desplaçament % Desplaçament 0 40 80 120

C18-RCAN1-CnA C18-RCAN3-CnA SPRIEIT-CnA

interacció 100PM 50PM 20PM 10PM 0 40 80 120

C18-RCAN1-CnA C18-RCAN3-CnA SPRIEIT-CnA

interacció

100PM 50PM 20PM 10PM

100PM 50PM 20PM 10PM

RCAN3-Cn i SPRIEIT-Cn en presència de concentracions decreixents de producte IDI3A.

L

t diferents metodologies in vivo. Pel que fa al producte IDI3A es va fer mitjançant tres aproximacions:

ƒ Avaluació de la capacitat del producte I çant assaigs de tipus pull down.

ƒ Estudi de la capacitat d’in

NFAT en cèl·lules estimulades amb ionomicina.

ƒ Anàlisi del nivell d’expressió gènica de d sència del producte IDI3A.

3.5.5.1. Avaluació de la capacitat del producte IDI3A de competir la interacció RCAN-C

Amb la finalitat de reproduir in vivo la competició identificada in vitro es van realitza

o amb el product

nA mitjançant assaigs de tipuspull down

r assaigs pull down per determinar la interacció entre la CnA endògena de Jurkat i la construcció GST-RCAN3-2(178-203), que inclou el pèptid C18 de RCAN3 (Figura 37).

Els assaigs es van fer en presència de DMSO, que és el vehicle del producte,

e IDI3A emprant 1 mg de proteïna total de Jurkat com a font endògena de CnA. Es van utilitzar tres concentracions diferents de GST-RCAN3-2(178-203), considerades com a 1, 1/2 i 1/20 (Veure en detall el protocol emprat per fer el pull down, Materials i mètodes, Capítol II), donat que sabem per les corbes de saturació que C18-RCAN3 és moderadament afí per CnA. A la Figura 37, només es mostren les dades corresponents a les concentracions 1/2 i 1/20. Com a control negatiu d’interacció de l’assaig es va emprar la proteïna GST sola. La proteïna GST no interacciona amb CnA en cap de les dues concentracions analitzades ni en presència de DMSO ni de producte IDI3A (Figura 37A, imatges superior i inferior del costat esquerre, veure la proteïna GST en els carrils PD, per pull down, mentre que la CnA està en els carrils T, per través ). En canvi, la proteïna de fusió GST-RCAN3-2(178-203) interacciona amb CnA a les dues concentracions considerades, però menys quan la interacció es determina en presència del producte IDI3A (Figura 37B, imatges superior i inferior del costat dret, comparar la intensitat de la banda de CnA en els carrils PD en les cèl·lules tractades amb DMSO respecte les tractades amb el producte IDI3A). Aquestes bandes van ser quantificades i referides a la quantitat de proteïna GST o GST-RCAN3-2(178-203) presents en els carrils PD i els valors calculats es mostren a la Figura 37B. Els resultats obtinguts indiquen que el producte IDI3A es mostra més eficaç competint la interacció GST-RCAN3-2(178-203)-Cn en presència de concentracions baixes de proteïna GST-RCAN3-2(178-203). A més, aquestes dades mostren que el producte IDI3A és capaç de promoure un desplaçament in vivo d’un 20- 30% de la interacció RCAN3-2-Cn.

.5.5.2. Estudi de la capacitat d’inhibició de la translocació nuclear de NFAT en cèl·lule

Amb la finalitat d’analitzar si el producte IDI3A te una funció inhibidora sobre la via de seny

FP al citoplas

Figura 37. A. Competició in vivo de la interacció GST-RCAN3-2-(178-203)-CnA en presència del producte IDI3A a 100 PM. B.

Representació gràfica del percentatge de desplaçament de la interacció promogut en presència del producte IDI3A a 100 _PM davant quantitats diferents de proteïna GST-RCAN3-2(178-203). PD, significa pull down. T, significa través.

3

s estimulades amb ionomicina

alització Cn-NFAT, es va determinar la seva capacitat d’inhibir la translocació nuclear de NFAT en cèl·lules transfectades amb NFAT-EYFP i estimulades amb ionomicina (Figura 38). Donat que el producte IDI3A és fluorescent es va poder determinar la seva entrada a les cèl·lules U-2 OS quan s’utilitzaven concentracions superiors a 20 PM. En altres tipus cel·lulars el percentatge d’incorporació del producte IDI3A va ser diferent (dades no mostrades).

A mode de control, les cèl·lules U-2 OS no estimulades mostren NFAT-EY ma (Figura 38A). Quan s’estimulen amb ionomicina, es produeix un increment en la concentració intracel·lular de Ca2+, i es promou la translocació completa de NFAT-EYFP a nucli presentant el patró característic en forma de speckles. Aquesta translocació nuclear no té lloc quan les cèl·lules són tractades prèviament a la estimulació amb un inhibidor de la Cn, com és la CsA. Aquest assaig es va realitzar en presència de diferents concentracions de producte IDI3A, de 0.1 a 50 PM, però a la Figura 38 només es mostren les imatges corresponents a les cèl·lules U-2 OS tractades amb una concentració final de 50 PM i estimulades posteriorment amb ionomicina. El patró general observat en les preparacions va ser el corresponent a la primera fila de fotografies de la Figura 38B identificada amb la lletra “a”: NFAT-EYFP localitza parcialment a nucli i parcialment en el citoplasma i el patró de

speckles que s’observa en el control tractat amb ionomicina passa a ser un patró nuclear difús en presència del producte IDI3A. A més, en un 25% del total de cèl·lules transfectades, NFAT- EYFP apareix totalment retingut al citoplasma (Figura 38B, línies de fotografies ”b”, “c” i “d”, cèl·lules indicades amb una fletxa blanca). Aquests resultats mostren que el producte IDI3A inhibeix la translocació nuclear de NFAT in vivo.

Figura 38. Inhibició de la translocació de NFAT-EYFP en cèl·lules U-2 OS tractades

.5.5.3. Anàlisi del nivell d’expressió gènica de diverses citoquines dependents de NFAT e

er confirmar si aquest efecte inhibidor del producte IDI3A respecte la translocació de NFAT te

amb el producte IDI3A A. Control de l’assaig en absència d’estímuls, en presència de ionomicina o en presència de CsA+ionomicina. B. Localització cel·lular de EYFP-NFAT en presència del producte IDI3A. Les quatre files indicades com “a”, “b”, “c” i “d” corresponen a cèl·lules estimulades amb ionomicina en presència de 50 PM de producte IDI3A. En vermell es mostra la proteïna EYFP-NFAT i en verd el producte IDI3A. Les fletxes blanques mostren cèl·lules amb NFAT-EYFP retingut totalment al citoplasma.

3

n presència del producte IDI3A

P

conseqüències envers la transcripció de gens dependents de NFAT, es va analitzar el nivell d’expressió gènica de diverses citoquines dependents de NFAT en cèl·lules Jurkat (Figura 39). Les cèl·lules van ser tractades amb concentracions creixents del producte IDI3A (des de 0.1 a 100 PM) i posteriorment estimulades amb ionomicina+PMA. A mode de control, les cèl·lules Jurkat no van ser estimulades o van ser tractades amb CsA prèviament a l’estimulació. Com ja s’ha comentat anteriorment, el producte IDI3A està dissolt en DMSO, així que per descartar possibles interferències provocades pel vehicle, es va igualar la quantitat de DMSO en tots els punts. Com a control de l’assaig es va determinar el nivell d’expressió de GAPDH. Totes les citoquines analitzades CSF2, IL2, IL3i TNF mostren que la seva expressió es dependent de Ca2+ i mediada per Cn (Figura 39, comparar els carrils (-), IP i

CIP, respectivament). La presència del producte IDI3A a 100 PM promou que el nivell d’expressió de CSF2, IL3 i TNF disminueixi, mentre que el de IL2, no (Figura 39, veure el carril corresponent a 100 PM en totes les citoquines analitzades). Els resultats obtinguts indiquen que el producte IDI3A disminueix el nivell d’expressió de diverses citoquines dependents de NFAT, de forma més destacada la de TNF, de manera dosi dependent.

Figura 39. Anàlisi de l’expressió gènica de diverses citoquines dependents de NFAT en presència de concentracions creixents de producte IDI3A. A mode de control, les cèl·lules van ser no estimulades (-), estimulades amb ionomicina i PMA (IP) o inhibides amb CsA prèviament a l’estimulació amb IP (CIP).