Caracterització funcional de la mutació c.659_660insT al gen YWHAZ

Mutagènesi, expressió i purificació de les formes WT i truncada de la proteïna 14-3-3ζ

La forma truncada de la proteïna 14-3-3ζ es va obtenir mitjançant un protocol de mutagènesi dirigida sobre un vector d’expressió pGEX-2TK (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) en què prèviament s’havia clonat el cDNA del gen YWHAZ humà a 3’ de la cua de GST (Glutatió-S-transferasa) del plàsmid. La mutagènesi es va dur a terme amb el kit comercial Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA).

La proteïna 14-3-3ζ unida a la cua de GST (proteïna de fusió GST-14-3-3ζ), en les seves formes WT i truncada (GST-14-3-3ζ_WT i GST-14-3-3ζ_mut), es va expressar fent servir la soca d’E.coli BL21 Codon Plus (Stratagene), mitjançant la seva inducció amb isopropil 1-tio-β-D-galactopiranòsid (IPTG) 1mM durant 4h a 30º C. A causa dels problemes de precipitació que presentava la GST-14-3-3ζ_mut es va avaluar la seva solubilitat mitjançant la inducció de l’expressió a diferents temps i temperatures sense obtenir cap millora, raó per la qual es va optar per la inducció durant 4h a 30ºC, condicions en què la producció era més elevada (Figura 10).

La lisi dels bacteris es va fer en un tampó fosfat salí (PBS, Phosphate buffered saline) amb 10 mM d’imidazol, 10mM de benzamidina, 0,5mg/mL de lisozima i inhibidor de proteases (Roche), mitjançant la

152

“premsa francesa”. Les proteïnes de fusió GST de la fase soluble del lisat mitjançant c sefarosa amb glutatió Glutathione Sepharose 4B

tot mesurant l’absorbància a λ=280nm i normalitzant els resultats per l’absorb total es van obtenir 23,5mg de GST

de solubilitat que presentava la proteïna truncada en comparació amb la WT.

Figura 10. Test de solubilitat de les proteïnes de fusió salvatge diferents temperatures i temps d’inducció amb IPTG (1

(en KDa); total: lisat cel·lular total; sol: fracció soluble del lisat cel·lular.

La cua de fusió de GST fou eliminada de la proteïna de fusió, tant de la

3ζ_mut, mitjançant la seva escissió proteolítica amb trombina, gràcies a la diana per a aquest enzim que inclou el plàsmid pGEX-2TK entre l’extrem 3’ de la cua de GST i e

proteïna d’interès. Es van fer servir 10 U de trombina (Tris 50mM, DTT 0,1M) per mg de proteïna a digerir, i es va incubar O/N a 4ºC. La proteïna 14

d’exclusió per mida, fent servir una columna de filtració en gel mateix tampó sense DTT.

Assaig de ressonància superficial de plasmons (Biacore)

Es va mesurar l’afinitat d’unió entre les proteïnes GST

la serina 19, unió que ja havia estat caracteritzada prèviament pel grup de la Universitat de Bergen (Halskau et al. 2009), amb l’instrument BIAcore 3000 (GE Healthcare). Totes les mesures i procediments es van realitzar a 25ºC, fent servir el tampó HBS

NaCl 150mM, i polisorbat 20 al 0,005%). Es va immobilitzar covalentment un anticòs contra la cua de GST a una matriu hidrofílica de dextrà carboxi

reacció estàndard descrita pel fabricant. Després, la proteïna de fusió GST

concentració de 7µg/mL en un volum de 90µL, amb un flux de 30 µL/min. Un cop unida la proteïna 14 3ζ (WT o mut) a l’anticòs per la cu

L’experiment es va fer amb la GST

d’unió) i després la TH fosforilada a nivell de la serina 19 (TH

el mateix protocol. Els sensogrames resultants es van analitzar amb el programa 3.2 (Biacore AB, Uppsala, Suècia).

remsa francesa”. Les proteïnes de fusió GST-14-3-3ζ_WT i GST-14-3-3ζ_mut es van purificar a partir de la fase soluble del lisat mitjançant cromatografia d’afinitat en columna, utilitzant una matriu de

Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare). La proteïna resultant es va quantificar λ=280nm i normalitzant els resultats per l’absorbància de la c

total es van obtenir 23,5mg de GST-14-3-3ζ_WT i 1,5mg de GST-14-3-3ζ_mut, a causa dels problemes de solubilitat que presentava la proteïna truncada en comparació amb la WT.

Test de solubilitat de les proteïnes de fusió salvatge (GST-14-3-3ζ_WT) i truncada (GST

diferents temperatures i temps d’inducció amb IPTG (1-tio-β-D-galactopiranòsid). M: marcador de pes molecular ; total: lisat cel·lular total; sol: fracció soluble del lisat cel·lular.

ió de GST fou eliminada de la proteïna de fusió, tant de la 14-3-

_mut, mitjançant la seva escissió proteolítica amb trombina, gràcies a la diana per a aquest enzim que 2TK entre l’extrem 3’ de la cua de GST i el lloc de clonatge del cDNA de la proteïna d’interès. Es van fer servir 10 U de trombina (Tris 50mM, DTT 0,1M) per mg de proteïna a digerir, i es va incubar O/N a 4ºC. La proteïna 14-3-3ζ sense cua GST es va purificar per cromatografia

fent servir una columna de filtració en gel Superdex 200 10/30 (GE Healthcare)

Assaig de ressonància superficial de plasmons (Biacore)

Es va mesurar l’afinitat d’unió entre les proteïnes GST-14-3-3ζ WT i mutada i la TH fosfor

la serina 19, unió que ja havia estat caracteritzada prèviament pel grup de la Universitat de Bergen , amb l’instrument BIAcore 3000 (GE Healthcare). Totes les mesures i procediments servir el tampó HBS-P proporcionat pel fabricant (Hepes 10mM a pH 7.4, NaCl 150mM, i polisorbat 20 al 0,005%). Es va immobilitzar covalentment un anticòs contra la cua de GST a una matriu hidrofílica de dextrà carboxi-metilat (Sensor Chip CM5, GE Healthcar

reacció estàndard descrita pel fabricant. Després, la proteïna de fusió GST-14-3

concentració de 7µg/mL en un volum de 90µL, amb un flux de 30 µL/min. Un cop unida la proteïna 14 (WT o mut) a l’anticòs per la cua de GST, s’injectava la TH (1,3µg/mL) amb el mateix flux. L’experiment es va fer amb la GST-14-3-3ζ_WT, injectant primer la TH no fosforilada (control negatiu d’unió) i després la TH fosforilada a nivell de la serina 19 (TH-PSer19), i amb la GST

el mateix protocol. Els sensogrames resultants es van analitzar amb el programa 3.2 (Biacore AB, Uppsala, Suècia).

_mut es van purificar a partir romatografia d’afinitat en columna, utilitzant una matriu de (GE Healthcare). La proteïna resultant es va quantificar ància de la cua de GST. En _mut, a causa dels problemes

_WT) i truncada (GST-14-3-3ζ_mut) a galactopiranòsid). M: marcador de pes molecular

-3ζ_WT com de la 14-3- _mut, mitjançant la seva escissió proteolítica amb trombina, gràcies a la diana per a aquest enzim que

l lloc de clonatge del cDNA de la proteïna d’interès. Es van fer servir 10 U de trombina (Tris 50mM, DTT 0,1M) per mg de proteïna a sense cua GST es va purificar per cromatografia Superdex 200 10/30 (GE Healthcare) en el

WT i mutada i la TH fosforilada a nivell de la serina 19, unió que ja havia estat caracteritzada prèviament pel grup de la Universitat de Bergen , amb l’instrument BIAcore 3000 (GE Healthcare). Totes les mesures i procediments P proporcionat pel fabricant (Hepes 10mM a pH 7.4, NaCl 150mM, i polisorbat 20 al 0,005%). Es va immobilitzar covalentment un anticòs contra la cua de , GE Healthcare) mitjançant la 3-3ζ fou injectada a una concentració de 7µg/mL en un volum de 90µL, amb un flux de 30 µL/min. Un cop unida la proteïna 14-3-

a de GST, s’injectava la TH (1,3µg/mL) amb el mateix flux. _WT, injectant primer la TH no fosforilada (control negatiu PSer19), i amb la GST-14-3-3ζ_mut, seguint el mateix protocol. Els sensogrames resultants es van analitzar amb el programa BIAevaluation, versió

153

Figura 11. Sensograma dels experiments de ressonància superficial de plasmons (RSP), on s’indiquen les unitats de resposta (UR) per unitat de temps en segons (Temps (s)). El moment de la injecció de la tirosina- hidroxilasa (TH) s’indica amb una fletxa sobre el gràfic, mentre que el color d’aquest representa l’estat de fosforilació de la serina 19 de la proteïna injectada (PSer19). El gràfic (A) correspon a l’experiment de RSP dut a terme amb la forma salvatge de la proteïna 14-3-3ζ (14-3-3ζ_WT); el gràfic (B) representa l’experiment de RSP dut a terme amb la proteïna 14-3-3ζ truncada: p.L220Ffs*18 (14-3-3ζ_mut).

Tot i que de moment només disposem de resultats preliminars, es va observar una diferència notable entre la proteïna salvatge i la truncada en l’afinitat pel residu de serina fosforilat de la TH, ja que la segona no va mostrar cap resposta a la injecció de la TH-PSer19 (Figura 11).

Assaig de filtració en gel

La capacitat de formació de dímers de les proteïnes 14-3-3ζ_WT i 14-3-3ζ_mut, tant homodímers com heterodímers amb la isoforma 14-3-3ε, es va investigar mitjançant cromatografia d’exclusió per mida (CEM), fent servir una columna analítica de filtració en gel Sephadex 200 (GE Healthcare). La columna CEM es va calibrar amb un kit comercial (GE Healthcare) d’acord amb les instruccions del fabricant. Es van injectar 55µL de cada proteïna a una concentració de 16µM a la columna en un tampó d’Hepes 15mM a pH 7,4. Per a la formació dels heterodímers de les isoformes salvatge i mutada de la 14-3-3ζ amb la 14-3-3ε, es van barrejar i incubar quantitats equimolars de les dues isoformes (ζ, WT o mut, i ε) durant 1h a temperatura ambient. Tant la proteïna WT com la mut van formar heterodímers amb la proteïna 14-3-3ε, fenomen que es va poder observar gràcies a la cua de MBP (Maltose Binding Protein, proteïna d’unió a maltosa) que incorporava la isoforma ε i que proporcionava una mida superior i distingible als homodímers 14-3-3 ε:ε i als heterodímers 14-3-3 ε:ζ en relació a l’homodímer 14-3-3ζ:ζ (Figura 12).

154

Figura 12. Fusió dels cromatogrames resultants de la injecció de l’homodímer MBP-14-3-3 ε: ε (verd), l’homodímer 14-3-3ζ_WT:ζ_WT (lila), i els heterodímers MBP-14-3-3 ε:14-3-3ζ_WT (blau fosc) i MBP-14-3-3 ε:14-3-3ζ_mut (blau clar) a la columna de filtració en gel Sephadex 200 (GE Healthcare). Es representen les unitats d’absorbància a λ=280nm (UA) en funció del temps en minuts (Temps (min)).