Genètica molecular de l'autisme: recerca de variants de susceptibilitat i estudis funcionals

226  Download (0)

Full text

(1)Genètica molecular de l'autisme: recerca de variants de susceptibilitat i estudis funcionals Bàrbara Torrico Aviles. ADVERTIMENT. La consulta d’aquesta tesi queda condicionada a l’acceptació de les següents condicions d'ús: La difusió d’aquesta tesi per mitjà del servei TDX (www.tdx.cat) i a través del Dipòsit Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha estat autoritzada pels titulars dels drets de propietat intel·lectual únicament per a usos privats emmarcats en ac tivitats d’investigació i docència. No s’autoritza la seva reproducció amb finalitats de lucre ni la seva difusió i posada a disposici ó des d’un lloc aliè al servei TDX ni al Dipòsit Digital de la UB. No s’autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX o al Dipòsit Digital de la UB (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant al resum de presentació de la tesi com als seus continguts. En la utilització o cita de parts de la tesi és obligat indicar el nom de la persona autora. ADVERTENCIA. La consulta de esta tesis queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso: La difusión de esta tesis por medio del servicio TDR (www.tdx.cat) y a través del Repositorio Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha sido autorizada por los titulares de los derechos de propiedad intelectual únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro ni su difusión y puesta a disposición desde un sitio ajeno al servicio TDR o al Repositorio Digital de la UB. No se autoriza la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR o al Repositorio Digital de la UB (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al resumen de presentación de la tesis como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes de la tesis es obligado indicar el nombre de la persona autora. WARNING. On having consulted this thesis you’re accepting the following use conditions: Spreading this thesis by the TDX (www.tdx.cat) service and by the UB Digital Repository (diposit.ub.edu) has been authorized by the titular of the intellectual property rights only for private uses placed in investigation and teaching activities. Reproduction with lucrati ve aims is not authorized nor its spreading and availability from a site foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository. Introducing its content in a window or frame foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository is not authorized (framing). Those rights affect to the presentation summary of the thesis as well as to its contents. In the using or citation of parts of the thesis it’s obliged to indicate the name of the author..

(2)

(3) Genètica molecular de l’autisme: recerca de variants de susceptibilitat i estudis funcionals. Memòria presentada per Bàrbara Torrico Avilés. Per optar al grau de Doctora per la Universitat de Barcelona Programa de Genètica Departament de Genètica Curs 2014/2015. Tesi dirigida pel Dr. Bru Cormand Rifà i el Dr. Claudio Toma al Departament de Genètica de la Universitat de Barcelona. Dr. Bru Cormand Rifà. Dr. Claudio Toma. Bàrbara Torrico Avilés 2015.

(4) Als avis, naturals i d’adopció, i a la meva iaia.

(5)

(6) AGRAÏMENTS En primer lloc, donar les gràcies als meus directors, en Bru i en Claudio. Claudio Al primer, per fer-me sentir la seva confiança. Al segon, per mostrar-me en ocasions certa “desconfiança”, perquè només dels errors s’aprèn. Gràcies per ser tan propers, per acollir-me, intentar traspassar-me una mica del vostre coneixement, animar-me i donar-me el vostre suport quan heu vist que el necessitava. Mereixen una menció especial les meves nenes, per ajudar-me a tirar endavant aquesta tesi. A l’Alba Alba, Alba perquè espero haver aprés almenys una mica de les teves seguretat, empenta i meticulositat. A la Laura Noguera, Noguera que em va ajudar quan més atabalada estava. A la Norma, Norma perquè la teva alegria fa passar fàcilment la feina més farragosa. I a la Laura Pineda, Pineda perquè les ganes són només el principi. A la gent del lab, a tots els que han passat per aquí i amb els que he tingut la sort de coincidir, perquè és el conjunt el que ha creat el millor ambient on qualsevol voldria treballar. El pressupost limitat a què es veu sotmesa la enquadernació d’aquesta tesi (bé, la voluntat que els agraïments no superin en volum a la resta de les seccions del treball) m’obliga a ser injusta, i a no dedicar-vos unes línies a cadascú de vosaltres. Espero em sapigueu perdonar. Oriel, Oriel gràcies per deixar-me conèixer-te, perquè m’hagués perdut una dona extraordinària i una bona amiga. Cèlia, Cèlia com d’afortunada em sento que haguem pogut viure juntes els millors moments d’aquests anys, però més encara els pitjors i més desesperants. Espero poder continuar aprenent de tu. Gràcies. Noe, Noe no tinc paraules per donar-te les gràcies. Per la teva paciència, la voluntat que sempre tens d’ensenyar, la teva professionalitat, però sobre tot pel teu caràcter i per la teva manca de filtre alhora de triar els amics. Crec que m’hi he colat, i m’agrada, i m’hi penso quedar. Moni, Moni nuestra MacGyver, qué hubiera sido de mí en el lab sin ti. Gracias por enseñarme que, con frecuencia, los aparatos se arreglan enchufándolos a la corriente, y gracias porque eso no haya sido todo lo que he podido aprender de ti. Isaac, Isaac has fet dels dies llargs de feina dies divertits. Gràcies per apropar-nos a les teves muses. Marta, Marta nuestra heroína, eres única. Tienes una empatía enorme, siempre haciendo tuyos los problemas y preocupaciones de los demás. Gracias por estar siempre ahí, gran compi de poyata. Jenny, Jenny pots ser l’alegria entrant per la porta. No deixis que la feina i les ganes de fer-ho tot bé entrin en conflicte amb la gran persona que ets. M’has ensenyat moltes coses, però deixa’m dir-te que has de comença a veure el got mig ple, perquè així és com el tens. Lauri, Lauri qué bien que hayamos podido seguir teniéndote por el lab, porque sin tus prisas y tu sentido común todo cojea. Roser, Roser t’he d’agrair moltes coses, entre elles que sempre tinguis un minut, que no em deixessis tornar-te el Congo al segon dia de no poder dormir i, molt.

(7) especialment, que em dediquessis la definició més bonica amb què mai ningú s’ha dirigit a la meva persona. Això es pot posar al currículum? A la nova generació, no podríem haver triat un millor relleu a les que marxem. Si us plau, no ens feu quedar massa malament, i fiqueu la pota de tant en tant. La vostra il—lusió és la inspiració d’altres, gràcies per deixar-me entrar al vostre cercle, o fer-me sentir que hi entrava, ja sabeu que a la gent gran ens emociona especialment el respecte del planter. Judit, Judit Neus, Neus Núria, Núria Noelia: Noelia gràcies! I a tots els “jefes” de la planta, per cohesionar, per fer grup. Perquè és qui porta la batuta qui organitza els moviments de l’orquestra, i la nostra orquestra “casi” sempre afina! És de justícia recordar també als companys d’altres laboratoris. A la Mariona, Mariona per somriure fins i tot mentre es baralla amb els westerns, i per tenir sempre un segon per donar-te pistes sobre aquestes lluites. A l’Ona Ona, Edu i l’Eva Eva, Ona l’Edu Eva per apuntar-se sempre a un bombardeig i per ser uns excel—lents companys de passadís, tot i ser unes víctimes constants de les nostres malifetes. A la Majo, Majo la Núria i el Victor, Victor per acceptar amb esportivitat que sovint necessitem la seva ajuda, i rebre’ns alegrement al seu territori. Al Miquel i al Jose, Jose que aporten la seva simpatia i el seu esforç a estretar els llaços intradepartamentals. Vull també donar les gràcies als companys i supervisors que vaig tenir a Bergen, per fer-me sentir benvinguda i per oferir-me la seva ajuda en tot moment. Ian, Ian Rune, Rune Sadaf Sadaf, Ana, Ana Mònica: Mònica tusen takk! Al Toni i a l’Àlex Àlex, Àlex perquè junts vam fer mates el primer dia a primera hora, i junts hem superat els esglaons que ens han portat fins a aquí. Toni, la teva passió per tot el que fas fa de tu un gran home. Gràcies per compartir tots aquests anys amb mi! I gràcies també als altres amics de la carrera, perquè “compartida, la biologia es más”: Lara, Lara Ester, Ester Miguel, Miguel Laura, Laura Daniela, Daniela Carlos. Carlos Al Congo, Congo perla seva companyia silenciosa tots els dies i nits de feixuga escriptura. A la meva família, per fer seves les meves il—lusions, per recolzar-me sempre i treballar perquè poguéssim tenir opcions. A la mama, mama por no dejarme ir a menudas estrellas, y al papa, papa por ponerme en bucle a toooodos los animalitos de la 2 y llevarnos de excursión a toooodas las montañas. A la Carla, Carla porque alguien como yo necesita como hermana a alguien como tú. Y sobre todo a los yayos, yayos por todo, porque no podrían haber hecho más por todos nosotros. Os quiero. Jo he treballat la tesi, però has estat tu qui l’ha patit. Qui ha patit tant les presències com les absències, sempre amb bona cara, perquè em vaig coneixent i sé que sovint és difícil. Per acompanyar-me, ajudar-me i animar-me sempre. Perquè sense tu no hagués estat possible. Gràcies, Ramon. Ramon.

(8) RESUM Els trastorns de l’espectre autista (TEA) són trastorns greus del neurodesenvolupament, caracteritzats per una discapacitat en la comunicació, tant verbal com no verbal, la limitació de la interacció social i comportaments i interessos restrictius i repetitius. La seva prevalença s’estima entre el 0,5% i l’1%, amb una mitjana de 4 vegades més homes afectats que dones. Els estudis familiars i de bessons indiquen una àmplia contribució genètica als TEA. Tot i això, el coneixement actual sobre aquests factors genètics és encara limitat, i les causes de la malaltia continuen plantejant una qüestió important. El treball que es presenta en aquesta Tesi Doctoral ha permès identificar variació genètica de risc als TEA. Així, s’ha avaluat la participació en autisme de variants rares del gen candidat PTCHD1, mitjançant el seu cribratge mutacional, i de gens que codifiquen microRNAs, per seqüenciació massiva. També s’ha estudiat la participació de variants genètiques de susceptibilitat, mitjançant estudis d’associació cascontrol poblacionals, en el anteriors candidats: PTCHD1 i els gens de microRNA. S’ha dut a terme el primer estudi sistemàtic de la contribució als TEA de variants rares heretades, mitjançant la seqüenciació d’exomes de 10 famílies múltiplex. Aquest estudi va suggerir nous gens candidats, entre els quals destacava el gen de densitat post-sinàptica YWHAZ. A continuació, es va analitzar la família de gens 14-3-3, a la qual pertany YWHAZ, mitjançant un estudi d’associació cas-control amb polimorfismes dels set gens de la família, i el cribratge mutacional dels mateixos a una mostra de pacients per seqüenciació d’alt rendiment, amb l’objectiu d’avaluar la contribució de variants comunes i rares en aquests gens als TEA. S’han realitzat estudis funcionals de dues de les variants rares descrites en aquests treballs: una duplicació de 27 pb a la regió promotora del gen PTCHD1, identificada a tres pacients no emparentats mitjançant el cribratge del gen, i una mutació de canvi de pauta de lectura al gen YWHAZ, identificada a dos germans de l’estudi d’exomes a famílies múltiplex..

(9)

(10) ÍNDEX. INTRODUCCIÓ. 1. 1. L’Autisme. 3. 1.1. Introducció històrica i definició. 3. 1.2. Característiques clíniques. 4. 1.3. Fisiopatologia. 5. 1.4. Comorbiditats. 6. 1.5. Epidemiologia. 8. 2. Genètica de la malaltia 2.1. Importància dels factors genètics. 8 8. 2.2. L’autisme sindròmic. 10. 2.3. L’autisme idiopàtic. 12. 2.3.1. Estudi dels factors genètics de predisposició. 12. 2.3.2. Seqüenciació de nova generació (Next Generation Sequencing, NGS). 22. 2.4. Model genètic de l’autisme. 24. 3. Objectes d'estudi d'aquesta Tesi: de l’estudi d’un gen candidat a la seqüenciació d’exomes 26 3.1. PTCHD1. 26. 3.2. microRNAs. 28. 3.3. Seqüenciació d’exomes. 32. OBJECTIUS. 33. RESULTATS. 37. CAPÍTOL 1. 41. CAPÍTOL 2. 57. CAPÍTOL 3. 105. Annex a l’article 3. 147. 1. Antecedents. 147. 2. Objectius. 149.

(11) 3. Mètodes i Resultats 3.1. Obtenció de la mostra. 150 150. 3.2. Estudi de NMD del transcrit del gen YWHAZ portador de la variant c.659_660insT 150 3.3. Caracterització funcional de la mutació c.659_660insT al gen YWHAZ. 151. 3.4. Estudi d’associació cas-control. 154. 3.5. Cribratge mutacional dels set gens de la família 14-3-3. 157. DISCUSSIÓ 1. La mostra. 159 162. 1.1. Els pacients TEA. 162. 1.2. Els controls. 163. 2. Arquitectura genètica de l’autisme. 164. 2.1. Estudi de les variants comunes en TEA. 165. 2.2. Estudi de les variants rares en TEA. 166. 2.3. Gens i variants implicades en els TEA: una visió global. 173. 3. Limitacions dels nostres estudis. 174. 4. El problema de l’heretabilitat perduda. 176. 5. Perspectives de futur. 177. CONCLUSIONS. 181. BIBLIOGRAFIA. 185. APÈNDIX. 209.

(12) INTRODUCCIÓ.

(13)

(14) 1. L’Autisme 1.1. Introducció històrica i definició La paraula autisme deriva del grec auto- (αὐτός), que significa propi o d’un mateix. Fou utilitzada per primera vegada al 1911 pel psiquiatra Paul Eugen Bleuler, en referència al rebuig vers la realitat que presenten els pacients d’esquizofrènia (Fusar-Poli i Politi 2008). L'any 1943 Leo Kanner va utilitzar per primera vegada el terme autisme en la descripció d’una condició clínica que va definir com la “incapacitat innata d’establir contactes interpersonals” (Kanner 1943). Un any més tard, el pediatra Hans Asperger va publicar les seves observacions en un grup de nens i adolescents que mostraven problemes de comunicació i interacció social (Asperger 1944). Ambdós metges hipotetitzaren un origen neurològic de l’autisme, en una primera temptativa de donar una explicació sobre la base biològica de la malaltia. Aquesta teoria es va deixar de banda ràpidament per les corrents psicoanalistes de l’època, que veien en el comportament autista una resposta a un ambient familiar fred generat per les anomenades “mares nevera”. Durant més de trenta anys es va debatre sobre la categorització més apropiada per a l’autisme, fins que a finals dels anys 70 es va reconèixer oficialment com a un trastorn independent i es va incloure a la tercera edició del Manual Diagnòstic i Estadístic dels Trastorns Mentals (DSM-III) (APA 1980). Aquesta revisió del manual incloïa una definició de l’autisme basada en la proposada per Michael Rutter, que hi identificava tres característiques essencials: manca d’interès en la gent, dificultats de comunicació i respostes inapropiades als estímuls ambientals (Rutter 1978). Des d’aleshores, les subsegüents edicions del manual han anat ampliant la seva definició, entenent l’autisme com un espectre fenotípic ampli amb diferents graus d’aïllament i habilitats cognitives. La quarta versió revisada del DSM (DSM-IV TR)(APA 2000) defineix l’autisme (OMIM #209850) com una patologia neuropsiquiàtrica greu, amb afectació de tres àrees bàsiques: incapacitat per desenvolupar uns hàbits normals d’interacció social, dificultats en la comunicació verbal i no verbal, i presència d’estereotípies comportamentals. Hi representa el prototip d’un conjunt més ampli de trastorns anomenats Trastorns de l’Espectre Autista (TEA) o Trastorns Generalitzats del Desenvolupament (TGD), que es diferencien entre ells en base a la capacitat intel·lectual dels pacients i a la severitat dels seus símptomes. A part de l’autisme clàssic, al DSM-IV TR la categoria dels TEA inclou: - La síndrome d’Asperger, que defineix els individus que, tot i presentar alteracions de la interacció social i patrons estereotipats de comportament, no tenen discapacitat intel·lectual ni retard del llenguatge. - TGD no especificats o TEA no especificats (TGD-NE o TEA-NE), que inclou els pacients que no compleixen tots els criteris per ser diagnosticats com a autistes, independentment que també presentin discapacitat intel·lectual o retard del llenguatge. - El Trastorn Desintegratiu Infantil (TDI), menys freqüent que les formes anteriors, es caracteritza per un desenvolupament normal durant almenys els primers dos anys de vida, seguit per la pèrdua posterior de les habilitats adquirides en dues de les tres àrees principals dels TGD. 3.

(15) La darrera revisió del manual, el DSM-5 (APA 2013), representa un canvi de direcció en la definició dels trastorns del desenvolupament respecte a les versions anteriors. Amb l’objectiu d’augmentar tant l’especificitat com la sensibilitat en el diagnòstic, fa servir el terme general de Trastorns de l’Espectre Autista, sense definir subtipus, que desapareixen del manual diagnòstic. Per primera vegada descriu la malaltia en base al compromís entre dues àrees: dificultats en la comunicació i interacció social, i activitats restrictives i repetitives.. 1.2. Característiques clíniques Els símptomes dels TEA apareixen a l'inici de la infància. Tot i la dificultat que comporta fer un diagnòstic abans dels 24-36 mesos d’edat (Bailey et al. 1995), el seguiment de germans de nens afectats ha permès identificar diferents predictors primerencs de la malaltia, com ara: manca d’atenció a les escenes socials o a les cares humanes als 6 mesos d’edat, interacció limitada amb els pares als 12 mesos o baixa flexibilitat en el control de l’atenció o l'orientació visual als 7 i els 14 mesos (Lai et al. 2014). Es tracta d’un trastorn amb una gran variabilitat clínica d’un individu a un altre, amb diferents nivells de gravetat fins i tot entre membres afectats d’una mateixa família. Els pacients reclutats per a la realització d’aquesta Tesi han estat avaluats i diagnosticats seguint els criteris DSM-IV TR (Caixa 1). Així, un nen compliria els criteris diagnòstics per l’autisme si presenta almenys 6 dels 12 caràcters descrits a la Caixa 1, mostrant com a mínim dos de (1) i un de (2) i de (3). Caixa 1: Principals característiques clíniques de l’autisme Alteracions de la interacció social: Component no verbal del llenguatge: dificultat per mantenir la mirada, l’expressió facial, postura corporal i gestos en el context de la interacció social. Incapacitat d’establir vincles lúdics amb els companys. Manca de reciprocitat socio-emocional. En ocasions, les persones afectades necessiten la presència d’altres persones per compartir moments d’alegria, dificultat o interès, però no es presten a interpretar l’estat d’ànim de qui els envolta. Alteracions de la comunicació: Retard lleu o sever del desenvolupament de la parla, caracteritzat sovint per manca de flexibilitat en l’expressió, creativitat i imaginació. Aproximadament un terç dels individus no desenvolupen el sentit del passat. Manca de comunicació no verbal, mímica. Impossibilitat de gesticular i imitar. Manca de respostes emocionals. Incapacitat de modular la veu i donar-li el to adequat. Manca d’èmfasi o sorpresa en la comunicació no verbal Comportaments restrictius, estereotipats i repetitius: Activitats motores limitades a accions estereotipades o repetitives. Interès inusual per parts d’objectes, sovint els detalls no funcionals dels jocs. Els objectes són sovint eines per a les accions compulsives i repetitives. Angoixa pels petits canvis en l’entorn familiar. (Manual Diagnòstic i Estadístic dels Trastorns Mentals, 4a edició revisada, DSM-IV TR). És fonamental evitar errors i ambigüitats en el diagnòstic dels pacients. En el cas de l’autisme, s’han desenvolupat diverses eines clíniques per tal d’estandarditzar aquest procés i assolir una definició acurada del fenotip. L’ADI-R (Autism Diagnostic Interview) (Lord et al. 1994) és l’instrument més utilitzat avui dia per al diagnòstic dels TEA. Consisteix en una entrevista amb preguntes que s’engloben en cinc 4.

(16) àrees: àmbit general, comunicació, desenvolupament social, comportament repetitiu i hàbits de conducta. Un altre instrument és l’ADOS (Autism Diagnostic Observational Schedule), que valora de forma estructurada i estandarditzada les interaccions socials, la comunicació, el joc i l’ús imaginatiu dels objectes a les persones de qui se sospita que podrien patir autisme. Aquesta segona entrevista està pensada per ser realitzada per psicòlegs o personal entrenat, i la seva versió abreviada ha estat àmpliament utilitzada pels clínics (ADOS-G, Autism Diagnostic Observation Schedule-Generic) (Lord et al. 2000). Altres eines de diagnòstic són les de tipus “llista de verificació”, com la M-CHAT (Modified Checklist for Autism in Toddlers) (Robins et al. 2001). Més senzilles i ràpides que les anteriors, consten d’una relació de preguntes de resposta tancada (sí/no) per als pares o cuidadors. Tot i possibilitar la detecció de la malaltia a edats més primerenques (Kleinman et al. 2008), la seva elevada sensibilitat augmenta el risc d’obtenir un fals diagnòstic.. 1.3. Fisiopatologia S'han dut a terme molts estudis per tal d'identificar quins mecanismes fisiològics i moleculars constitueixen la base d’aquesta malaltia. S’han descrit alguns trets que difereixen de forma significativa entre pacients autistes i controls, relacionats amb determinades estructures cerebrals o patrons neuronals, regulació immunitària o nivells d’alguns neurotransmissors, però encara no està clar si aquestes alteracions tenen a veure amb les causes de l’autisme o si són manifestacions secundàries de la malaltia. Els descobriments més consistents són: Alteracions de l’estructura cerebral - Un 25-30% dels pacients presenten una mida de l’escorça frontal i de l’amígdala superior a la normal durant els primers dos anys de vida, característica que no s’observa posteriorment, quan aquest creixement queda estancat (Courchesne et al. 2004). L'escorça frontal està implicada en funcions executives i en la presa de decisions, mentre que l'amígdala forma part del sistema límbic i té relació amb el processament de les reaccions emocionals. - Reducció del volum del cos callós, l’estructura de matèria blanca més gran del cervell implicada en la connectivitat entre els dos hemisferis (Frazier i Hardan 2009, Frazier et al. 2012). - Disminució del nombre de neurones de l’amígdala, una estructura de matèria grisa amb un paper important en el processament de la memòria, la pressa de decisions i les reaccions emocionals, que forma part del sistema límbic (Schumann i Amaral 2006). - Disminució del nombre de cèl·lules de Purkinje cerebelars, implicades en plasticitat sinàptica i control motor. Diversos estudis sobre cervells post mortem de pacients han revelat una reducció en el número d’aquestes cèl·lules en relació al cervells d’individus sans, que es produiria durant el període prenatal tardà o durant el desenvolupament neonatal (Whitney et al. 2008). Alteracions funcionals Les tècniques de neuroimatge, com la ressonància magnètica funcional (funcional Magnetic Resonance Imaging, fMRI) o la ressonància magnètica amb tensor de difusió (Difussion Tensor Imaging, DTI), han fet palesa una alteració en la connectivitat neuronal entre diferents àrees del cervell dels pacients TEA. Consisteix en la pèrdua de funcionalitat de xarxes específiques del cervell, tot i que hi ha certa controvèrsia sobre la forma com aquestes xarxes queden alterades. En pacients adults s’ha descrit un 5.

(17) patró de disminució de la connectivitat de llarga distància, com ara la sincronització de les diferents àrees corticals, mentre que la connectivitat de curta distància, com la de l’àrea visual, és més gran que en controls (Parellada et al. 2014). Alteracions immunitàries S’ha descrit un patró d’inflamació neural persistent en estudis de cervells post mortem, tot convergint amb l’observació d’un augment de citocines proinflamatòries tant al sèrum com al líquid cefaloraquidi dels pacients TEA i els seus familiars (Goines et al. 2011, Li et al. 2009, Parellada et al. 2014). Alteracions dels sistemes de neurotransmissió S’han dut a terme nombrosos estudis per demostrar la implicació de diferents sistemes de neurotransmissió amb l'autisme, tot i que amb escassos resultats positius. Els sistemes serotoninèrgic i dopaminèrgic, però, en són una excepció, i són considerats uns bons candidats per als TEA. Aproximadament un terç dels autistes presenten nivells elevats de serotonina en sang i orina (Burgess et al. 2006, Croonenberghs et al. 2000). Mitjançant estudis de tomografia d’emissió de positrons (Positron Emission Tomography, PET), s’ha observat una menor disponibilitat de serotonina al SNC en els pacients en comparació amb controls (Cook i Leventhal 1996), així com una asimetria anòmala en la síntesi d'aquest neurotransmissor a l’escorça frontal, temporal i parietal (Chandana et al. 2005). A més, l’ús d’inhibidors selectius de la recaptació serotoninèrgica i d’antagonistes dels receptors de dopamina, mostra un efecte positiu en la reducció d’alguns símptomes específics associats amb l’autisme, com l’agressivitat o la compulsivitat (Nikolov et al. 2006). Per altra banda, sembla que l’activitat dopaminèrgica estaria alterada a l’escorça prefrontal, medial i anterior dels individus autistes (Rumsey i Ernst 2000).. 1.4. Comorbiditats Una de les característiques dels TEA és l’elevat grau de comorbiditat amb d'altres patologies, tant en la població infantil com en l’edat adulta. En general, més del 70% dels pacients presenten alguna comorbiditat, i en aquests casos el trastorn també s’ha descrit com a “Autisme plus” (Gillberg i Fernell 2014, Lai et al. 2014) (Figura 1). Les més importants són la Discapacitat Intel·lectual (DI), el Trastorn per Dèficit d’Atenció i Hiperactivitat (TDAH) i l’Epilèpsia, tot i que hi ha d'altres condicions força freqüents, com els trastorns del son, el retard del llenguatge, l’ansietat, els problemes gastrointestinals o immunitaris, les alteracions motores, la depressió o el Trastorn Obsessiu-Compulsiu (TOC), entre d'altres. La identificació i el diagnòstic acurat d'aquestes comorbiditats és clau en la millora de la qualitat de vida dels pacients, ja que algunes d’aquestes patologies associades a l’autisme tenen tractaments que poden disminuir el grau de discapacitat del malalt.. 6.

(18) Figura 1. Classificació fenotípica dels Trastorns de l’Espectre Autista (TEA) segons el Manual Diagnòstic i Estadístic dels Trastorns Mentals, 4a edició revisada (DSMIV TR). A més de l’alteració de les tres àrees principals (representades pels cercles de colors), l’espectre pot incloure Trastorn per Dèficit d’Atenció i Hiperactivitat (TDAH), Discapacitat Intel·lectual (DI) i altres comorbiditats mèdiques, com ara convulsions, malformacions cerebrals, dismorfologies generals, problemes gastrointestinals, etc.. Adaptat de Devlin et al. 2012. Discapacitat Intel·lectual (DI) La discapacitat intel·lectual es defineix per un coeficient intel·lectual inferior a 70 amb limitació de la conducta adaptativa, i és la condició que va associada amb més freqüència amb l’autisme. Tot i la dificultat amb què es troben sovint els especialistes per diagnosticar els dos trastorns per separat, donat que en casos de DI severa es produeixen també estereotípies, auto-lesions i problemes de llenguatge (Matson i Shoemaker 2009), s’estima que més del 30% dels pacients TEA presenten DI (Elsabbagh et al. 2012, Fombonne 2003, MMWR 2014). Un coeficient intel·lectual (CI) elevat dels pacients prediu una bona evolució de la malaltia a llarg termini, ja que està directament relacionat amb l’assoliment d’un alt grau d’independència durant l’edat adulta (Lai et al. 2014).. Trastorn per Dèficit d’Atenció i Hiperactivitat (TDAH) El TDAH es caracteritza per nivells d’impulsivitat, activitat i atenció inadequats per l’edat que té el pacient, que produeixen el seu deteriorament funcional ja abans dels 7 anys. La seva definició al DSM-IV exclou el seu co-diagnòstic amb els TEA, ja que donat que l’autisme és la condició més incapacitant, qualsevol signe d'inatenció, hiperactivitat o impulsivitat s’hauria d’atribuir a aquest diagnòstic. Tot i això, ha estat la comorbiditat més estudiada durant els darrers anys (Matson i Cervantes 2014). La nova versió del manual, el DSM-5, corregeix aquesta situació, ja que es calcula que al voltant del 50% dels pacients TEA compleixen els criteris diagnòstics per a almenys un dels subtipus de TDAH (Murray 2010). S’ha observat una forta correlació entre el diagnòstic TEA amb un alt CI i el co-diagnòstic de TDAH (Simonoff et al. 2013). Per facilitar la distinció entre els dos trastorns quan es produeixen a la vegada, i donat l’elevat grau de solapament entre alguns dels seus símptomes, actualment s’estan desenvolupant diferents mètodes per al diagnòstic de TDAH en pacients autistes (Matson et al. 2013). Aquesta tasca és important per poder millorar el tractament i donar un pronòstic acurat als pacients, ja que els casos en 7.

(19) què concorren ambdós trastorns presenten problemes psicosocials més greus, i sovint disminueix la resposta al tractament concret de cadascuna de les malalties (Leitner 2014). Epilèpsia L’epilèpsia ja va ser descrita per Kanner en les seves observacions del fenotip autista. Prop del 15-25% dels pacients de TEA pateixen també epilèpsia, tot i que aquesta proporció varia àmpliament en els diferents estudis (Lo-Castro i Curatolo 2014, Trauner 2014). L’aparició de les convulsions epilèptiques mostra un comportament bimodal, amb un pic durant la infància i un altre en l’adolescència (Maski et al. 2011). Per altra banda, fins el 60-80% dels pacients autistes que mai han presentat episodis de convulsions mostren electroencefalogrames (EEG) anòmals (Gilby i O'Brien 2013, Jeste 2011, Trauner 2014). La comorbiditat de l’autisme amb la discapacitat intel·lectual o amb altres trastorns neurològics, com la síndrome de Rett, la tuberosi esclerosa o la neurofibromatosi de tipus I, s’han descrit com a factor de risc per a l’epilèpsia (El Achkar i Spence 2015). Aquesta elevada taxa de concurrència porta a la recerca dels mecanismes fisiopatològics comuns subjacents, però també de possibles relacions de causalitat entre les dues patologies.. 1.5. Epidemiologia La prevalença de l’autisme ha sofert aparentment un gran augment al llarg de les últimes dècades. El primer estudi epidemiològic va estimar que 4,1 de cada 10.000 habitants del Regne Unit patia autisme (Lotter 1966). Els estudis duts a terme durant els anys 90 i principis dels 2000 situen la prevalença de l’autisme al voltant de 18 de cada 10.000 habitants. En treballs posteriors, on s’han tingut en compte també els diversos subtipus de TEA, s’ha calculat una prevalença d’entre 50 i 100 de cada 10.000 individus (Chakrabarti i Fombonne 2005, Elsabbagh et al. 2012, Fombonne 2009). Les causes d’aquest increment s'han discutit sovint a la literatura. Donada la complexa naturalesa del trastorn i el gran desconeixement que encara hi ha sobre la seva etiologia, no es pot descartar que hi hagi hagut un increment dels factors de risc ambientals. En gran part, però, la idea general és que tant l’estandardització del diagnòstic, que ha ampliat els criteris per incloure tots els TEA, com una major conscienciació de la població, que permet un diagnòstic més precoç, són factors que explicarien l’augment de casos durant les últimes dècades. A més, tots els estudis epidemiològics coincideixen a descriure una major prevalença dels TEA entre la població masculina respecte de la femenina, amb una relació mitjana estimada de 4:1 (Fombonne 2009, MMWR 2014).. 2. Genètica de la malaltia 2.1. Importància dels factors genètics L’Autisme és una de les malalties neuropsiquiàtriques amb una heretabilitat més elevada. L’heretabilitat es defineix com la proporció de la variabilitat fenotípica d’un determinat tret de la població que pot ser. 8.

(20) atribuïda a la variabilitat genètica. En el cas dels TEA s’han fet servir principalment dos tipus de disseny experimental per estimar aquest índex: els estudis de recurrència familiar i els estudis de bessons. Els estudis de recurrència familiar indiquen la probabilitat que un familiar de determinat grau del proband presenti també la malaltia, respecte a la prevalença d’aquesta a la població general. Els primers estudis d’aquest tipus els anys ’80 van estimar al voltant del 3% la recurrència de l’autisme en germans, la qual cosa suposava un risc relatiu entre familiars 75 vegades superior al poblacional, aleshores calculat en 4 de cada 10.000 individus (Bailey et al. 1998). L’augment de la prevalença dels TEA deixaria aquesta diferència en un risc unes 4 vegades superior al poblacional. Una de les limitacions d’aquests primers estudis, però, és la possible subestima de la recurrència com a conseqüència de l’anomenat efecte “stoppage”. Aquestes investigacions es basaven en famílies amb almenys un fill autista, però cal tenir en compte que tenir un fill amb aquesta patologia condiciona molts pares a no tenir més fills. Un estudi més recent tracta de corregir aquest biaix fent servir una mostra poblacional de famílies que, tenint un fill o filla autista, n’han tingut més: la mostra del Baby Siblings Research Consortium (consorci de recerca en germans). Aquest article mostra una taxa de recurrència mitjana entre germans de gairebé el 20%, xifra que augmentaria com a conseqüència de dos factors principals: que el nou germà sigui nen, o que hi hagi més d’un germà gran amb diagnòstic TEA (Ozonoff et al. 2011). A més, s’ha observat una reducció en la prevalença de la malaltia a mesura que augmenta el grau de parentiu. El risc de patir el trastorn disminueix gairebé a la meitat entre parents de segon o tercer grau (Maestrini et al. 1998, Szatmari et al. 1998). L’estudi de familiars de pacients autistes ha conduït a la descripció d’una conducta que s’ha anomenat “fenotip autista ampli” (Broader Autism Phenotype, BAP), observada entre pares i germans dels afectats, i que descriu la presència de trets autistes que en qualsevol cas no compleixen els criteris diagnòstics dels TEA (Ronald i Hoekstra 2011). Un elevat grau d’agregació familiar, però, no implica obligatòriament una elevada càrrega genètica de la malaltia, ja que sovint els membres d’una mateixa família no només comparteixen informació genètica, sinó també un mateix ambient. Una eina alternativa per investigar la importància relativa dels factors genètics vers els ambientals en el desenvolupament del fenotip autista són els estudis de bessons. El primer treball d’aquest tipus es va dur a terme l'any 1977 amb 21 parelles de bessons: 11 monozigòtics (MZ) i 10 dizigòtics (DZ) (Folstein i Rutter 1977). Van descriure una concordança del 36% en bessons MZ i del 0% en DZ per a l’autisme estricte, i del 82% i el 10%, respectivament, tenint en compte el fenotip ampli de la malaltia (BAP). Tot i la petita mida mostral, els seus resultats van ser replicats pels subsegüents estudis del mateix tipus (Ritvo et al. 1985, Steffenburg et al. 1989). L'any 1995 Bailey et al. van ampliar la mostra inicial de Folstein i Rutter a 25 parelles de bessons MZ, 20 de DZ i 2 trigèmins, obtenint resultats similars: concordança per a l’autisme del 60% en bessons MZ i del 0% en DZ; concordança per al fenotip ampli de 92% en MZ i 10% en DZ (Bailey et al. 1995) (Figura 2). Aquests darrers anys s’han publicat més de 30 estudis de bessons en TEA. Els valors mitjans de concordança entre bessons són, per als primers treballs basats en una definició estricta de l’autisme, del 76% en MZ i 0% en DZ. En els treballs on es defineix la mostra dins de l’espectre de trastorns autistes (TEA), la concordança mitjana entre MZ és del 88%, i del 31% en DZ (Ronald i Hoekstra 2011). Les diferències entre bessons MZ i DZ s’han replicat consistentment. La major concordança entre bessons MZ que entre DZ dóna una idea de la importància dels factors genètics en la susceptibilitat a l’autisme. De fet, en el mateix treball de 1995, Bailey et al. fan una estimació de l’heretabilitat de l’autisme al voltant del 90%, la més gran entre les malalties psiquiàtriques (Bailey et al. 1995), tot i que 9.

(21) estudis més recents la situen al voltant del 80% (Sullivan et al. 2012). Un altre treball analitza els tres trets autistes principals en una mostra poblacional, obtenint unes mesures d’heretabilitat més moderades: del 58% per a la component social, i al voltant del 75% per als problemes de comunicació i els comportaments repetitius i estereotipats (Robinson et al. 2012).. Figura 2. Concordança entre bessons monozigòtics (MZ) i dizigòtics (DZ) en els diferents fenotips relacionats amb els Trastorns de l’Espectre Autista. Adaptat de Bailey et al. 1995.. 2.2. L’autisme sindròmic Entre el 10 i el 20% dels casos de TEA tenen una causa genètica coneguda, en què la presència d’autisme o trets autistes està associada a síndromes monogèniques (Betancur 2011). És el que es coneix com a autisme sindròmic. Hi ha diverses síndromes genètiques, causades per mutacions en un únic gen, que presenten una freqüència de TEA més gran de l’esperada si prenem com a referència la població general, i no sempre associades a la presència de discapacitat intel·lectual (Zafeiriou et al. 2013). L’estudi de l’aparició de trets autistes en aquests pacients pot facilitar la identificació de possibles alteracions fisiològiques comunes entre les diferents síndromes, que permetin aprofundir en el coneixement de l’etiologia de l’autisme i senyalar gens o xarxes gèniques candidates. La síndrome del cromosoma X fràgil (fragile X syndrome, FXS, OMIM #300624) representa aproximadament la meitat dels casos de DI lligada al cromosoma X. Està causada per la repetició, més de 200 cops, del trinucleòtid CGG a la regió 5’ del gen FMR1, situat a la regió Xq27.3. Aquesta expansió afavoreix la hipermetilació d’aquesta regió i, per tant, el silenciament del gen. Es calcula que un terç dels pacients amb cromosoma X fràgil compleixen els criteris diagnòstics per l'autisme (segons ADOS-G i ADIR), mentre que un altre terç es podrien classificar com a TEA-NE. D’entre la resta d’afectats, la majoria mostra almenys un dels trets autistes característics (Harris et al. 2008). MECP2 codifica la proteïna MeCP2 (metil-CpG-binding protein 2), que s’uneix a illes CpG metilades per reprimir la transcripció. Mutacions de pèrdua de funció en el gen MECP2 són responsables del 70% dels casos de síndrome de Rett (OMIM #312750) en nenes, mentre que en nens aquestes alteracions són generalment letals. Segons el tipus de mutació, la seva localització dins del gen i el patró d’inactivació del cromosoma X de l’individu, poden aparèixer diferents fenotips, com DI lleu, autisme, problemes d’aprenentatge o fins i tot fenotips asimptomàtics (Chahrour i Zoghbi 2007, Lam et al. 2000).. 10.

(22) L’Esclerosi Tuberosa (tuberous sclerosis complex, TSC, OMIM #191100) és una malaltia autosòmica dominant caracteritzada per la presència de tumors benignes a diferents òrgans, entre ells el cervell. Està causada per mutacions en el gen TSC1, que codifica l’hamartina, o en el gen TSC2, que codifica la tuberina. Els pacients TSC presenten un ampli espectre de trastorns del neurodesenvolupament, incloent autisme en aproximadament el 50% dels casos, amb més probabilitat si el pacient té també discapacitat intel·lectual (Jeste i Geschwind 2014). La Neurofibromatosi de tipus I (NF1, OMIM #162200) és una malaltia autosòmica dominant causada per mutacions del gen NF1, situat a la regió 17q11.2. Aquest gen codifica la neurofibromina, una proteïna que actua com a supressora de tumors. Els pacients NF1 tenen una major susceptibilitat a l'aparició de tumors, tant benignes com malignes, al teixit nerviós. L’últim estudi realitzat sobre la prevalença de l’autisme entre els pacients amb neurofibromatosi es va elaborar l'any 1998, sota els criteris diagnòstics del DSM-III-R, i va calcular en un 4% els individus afectats per NF1 que també mostren un fenotip autista (Williams i Hersh 1998). Les mutacions a NF1, mitjançant l’activació de la via de senyalització d’mTOR, generen hipertròfia neuronal, la qual cosa pot conduir a la desorganització de la connectivitat neuronal i la plasticitat sinàptica, associades als TEA (Bourgeron 2009). Algunes síndromes metabòliques s’associen també amb l’autisme. És el cas del dèficit d’adenosuccinatliasa (OMIM #103050), una malaltia autosòmica recessiva causada per mutacions en el gen ADSL, que codifica l’adenilosuccinat-liasa. Té una clínica molt heterogènia, amb retard psicomotor, convulsions epilèptiques i, en el 80-100% dels casos, trets autistes (Persico i Napolioni 2013). En alguns casos, l’autisme s’ha vist associat amb síndromes causats per anomalies cromosòmiques. Tot i el malentès que aquest tipus d’anomalies només es presenten en individus amb dismorfologies o altres malformacions, alguns d’aquests trastorns cromosòmics s’observen en pacients de TEA l’única comorbiditat dels quals és la discapacitat intel·lectual. La síndrome de la deleció 2q37 (OMIM #600430), causada per una deleció de 1,2 a 10 Mb en aquesta regió, és una afecció rara en què l’autisme s’ha descrit en el 17-50% dels pacients, depenent del punt de ruptura (Zafeiriou et al. 2013). Les síndromes de deleció i duplicació de la regió 15q11-q13 són una de les principals causes de TEA, i representen fins a un 1% del total de casos. Les duplicacions maternes de la regió 15q11.2-q13 es consideren l’anomalia citogenètica més comuna entre els pacients amb autisme. Altres síndromes d’aquest grup són el cromosoma 15 isodicèntric (idic(15)), que presenta TEA en més del 90% dels casos, la síndrome de Prader Willi (deleció de 15q11-13 d’origen patern), amb un 19-36% de concurrència amb autisme, i la síndrome d’Angelman (deleció de 15q11-13 d’origen matern), un 50-61% dels pacients de la qual presenten també autisme (Persico i Napolioni 2013, Zafeiriou et al. 2013). La deleció del 22q11.2, també anomenada síndrome de DiGeorge o síndrome velo-cardio-facial (velocardiofacial syndrome, VCFS, OMIM #188400) també està associada amb l'autisme, tot i que hi ha certa discrepància sobre la freqüència amb què es presenta l'autisme en aquests individus, segurament per la complexitat del diagnòstic i els diferents mètodes utilitzats. Els càlculs oscil·len entre el 20 i el 50%, amb una major prevalença dels símptomes socials (Persico i Napolioni 2013, Zafeiriou et al. 2013). En els últims anys s’han descrit nombroses mutacions responsables de formes suposadament monogèniques d'autisme. Tot i així, es tracta de formes rares, cap d’elles responsable de més de l’1% 11.

(23) dels casos. Per exemple, s’han descrit nombroses mutacions en gens que codifiquen proteïnes essencials per a la formació, maduració i estabilitat de la sinapsi neuronal, com són les neuroligines, la família SHANK i les neurexines. Els gens que presenten amb més freqüència mutacions en pacients autistes són els següents: Els gens de les neuroligines van ser els primers a associar-se amb l’autisme. S’han trobat mutacions als gens NLGN3, NLGN4 i NLGN4X, tot i que en general es tracta de variants “privades” (que segreguen amb la malaltia en una sola família), que causen fenotips clínics molt heterogenis, des d’autisme sever fins a síndrome de Tourette (Lintas i Persico 2009). En un principi es van associar més aviat amb DI sindròmica. Per exemple, la primera mutació descrita al gen NLGN4X es va identificar en una família amb dos germans afectats de TEA, un amb autisme i discapacitat intel·lectual, i un altre amb síndrome d’Asperger i CI normal (Jamain et al. 2003). Més endavant, es va identificar una mutació truncant a NLGN4X que segrega en un pedigrí amb 13 homes de fenotips diversos: discapacitat intel·lectual no sindròmica, DI amb autisme i autisme no sindròmic (Laumonnier et al. 2004). La família SHANK comprèn tres gens: SHANK1, SHANK2 i SHANK3, que codifiquen proteïnes “bastida” del complex de densitat postsinàptica, on s’uneixen a les neuroligines (Durand et al. 2012). S'han descrit mutacions en els tres gens de la família en casos d’autisme, però d’aquests, el gen més freqüentment alterat és SHANK3, on es troben mutacions puntuals o delecions en el 0,85% del total dels pacients TEA (Persico i Napolioni 2013). Aquest gen està situat dins la regió crítica de la síndrome de deleció 22q13 o síndrome de Phelan-McDermid (OMIM #606232), una malaltia molt rara que cursa amb autisme en el 50-70% dels casos (Persico i Napolioni 2013); per tant, s’estableix una relació causal directa de la deleció de SHANK3 amb el fenotip resultant (Zafeiriou et al. 2013). Les neurexines estan codificades per tres gens molt conservats: NRXN1, NRXN2 i NRXN3. La interacció d’aquestes proteïnes amb les neuroligines precipita la formació dels botons presinàptics. També participen en l’alliberament de neurotransmissors (Betancur et al. 2009, Missler et al. 2003). El gen en què s'han identificat més canvis en pacients és el NRXN1, on diferents estudis han descrit mutacions disruptives, la majoria puntuals o de número de còpies (CNVs) (Persico i Napolioni 2013). El gen PTEN (phosphatase and tensin homolog) codifica un supressor tumoral que afavoreix l'aturada del cicle cel·lular a la fase G1 i l’apoptosi, i que s'ha relacionat amb un gran nombre de càncers. Al sistema nerviós central (SNC), la seva inactivació genera un augment del número de sinapsis (Kwon et al. 2006). Mutacions en aquest gen s’han relacionat amb l’autisme idiopàtic en presència de macrocefàlia (Courchesne et al. 2007), tot i que el seu efecte i penetrància són molt variables (Varga et al. 2009).. 2.3. L’autisme idiopàtic 2.3.1. Estudi dels factors genètics de predisposició L’estudi de les formes sindròmiques d’autisme ha aportat més de 100 loci amb evidències d'un paper en els TEA (Betancur 2011). Tot i aquests avenços, encara hi ha un gran desconeixement dels gens específics que contribueixen a la patogènia en la resta de casos, que pateixen les anomenades formes idiopàtiques d’autisme. En els darrers 20-30 anys, diferents grups d’investigació, molts d'ells agrupats en consorcis internacionals, han fet servir diverses aproximacions metodològiques per tractar d’identificar aquests gens.. 12.

(24) Els primers estudis que es van dur a terme van ser les anàlisis de lligament, per tal d’identificar regions cromosòmiques amb loci de susceptibilitat a l’autisme. L'anàlisi de lligament genètic permet identificar loci de risc en base a la cosegregació de marcadors genètics amb la malaltia en una família. N’hi ha de dos tipus: paramètrics, basats en el coneixement a priori del model genètic de la malaltia que estem estudiant, i no paramètrics, utilitzats quan no és possible inferir un model d’herència mendeliana concret. Les regions lligades a l'autisme aportades per aquest primers treballs, així com les regions implicades en alteracions cromosòmiques associades amb trets autistes, han estat útils per determinar gens candidats posicionals per als TEA. A més, al llarg dels anys s’han anat suggerint tota una sèrie de candidats funcionals, en base als seus patrons d’expressió o a una possible funció relacionada amb el desenvolupament o funcions del sistema nerviós central (SNC). Hi ha un gran nombre de treballs centrats en l’estudi d’aquests gens candidats, tant funcionals com posicionals. El desenvolupament de tècniques d'anàlisi genètica a gran escala féu possible l’elaboració d’estudis d’associació a escala genòmica (els anomenats Genome-Wide Association Studies, GWAS). Es tracta d’una aproximació “sense hipòtesis”, és a dir, no esbiaixada per coneixements previs sobre la localització o la funció de gens coneguts. Amb aquest tipus d’estratègies hom pretén identificar variants genètiques de susceptibilitat, encara que estiguin situades en regions intergèniques o en gens dels quals es desconeix la funció. Al contrari del que passa amb els estudis de lligament, més útils per a la detecció de variants altament penetrants (amb un impacte gran sobre el fenotip), els estudis d’associació són una eina molt potent per identificar variants comunes d’efectes individualment petits i additius sobre el fenotip. Existeixen també nombrosos estudis que han intentat determinar la influència de les variants de número de còpies (CNVs) sobre el fenotip dels TEA. Aquests treballs representen una continuïtat de les primeres anàlisis citogenètiques realitzades en autisme, però amb un gran salt qualitatiu quant a la resolució. Mentre que amb la citogenètica tradicional els canvis observables més petits tenen una longitud de 5-10Mb, les noves tecnologies d’Hibridació Genòmica Comparativa en arrays (array Comparative Genomic Hibridization, aCGH) i de microarrays de genotipació d’SNPs, han permès la detecció d’aquestes variants submicroscòpiques. Per últim, en els darrers tres anys ha tingut lloc l’explosió de l’ús de les tècniques de seqüenciació massiva (Next Generation Sequencing, NGS) per a la recerca de variants de susceptibilitat a l’autisme. Representa una eina poderosa per a la identificació de variants rares, amb una sensibilitat i especificitat de fins el 90% en la detecció de variants d’un sol nucleòtid (single nucleotide variants, SNV) i d’un 3070% per a petites insercions o delecions (indels) i variants estructurals (Ku et al. 2013). En els darrers anys, la tècnica de NGS més utilitzada ha estat la seqüenciació d’exomes (Whole Exome Sequencing, WES). No només té un cost més reduït que la seqüenciació del genoma, sinó que a més representa un repte analític menor. És òbviament més senzill determinar la possible patogenicitat de variants exòniques, situades en regions codificants del genoma, que en regions intergèniques, ja sigui fent ús de predictors bioinformàtics com mitjançant estudis funcionals. L’exoma comprèn el complement complet d’exons (uns 200.000) del genoma, la qual cosa representa unes 40Mb d’ADN, una quantitat relativament petita en comparació amb les 3.200Mb del total del genoma. Tot i que es tracta de poc més de l’1% del genoma, concentra el 85% de les mutacions patogèniques d’alta penetrància responsables de malalties mendelianes (Li et al. 2012a). El desenvolupament de diversos kits comercials per a la captura de l'exoma no només n'ha abaratit els costos, sinó que ha fet accessible aquesta tècnica en termes pràctics als laboratoris de tot el món, fent que el seu ús s’hagi estès de forma massiva. 13.

(25) Estudis de lligament genètic L’estratègia de les anàlisis paramètriques ha estat molt útil per a la identificació d’alguns gens implicats en diverses síndromes que tenen l'autisme com un fenotip freqüentment comòrbid, com FMR1 a la síndrome del cromosoma X fràgil (Verkerk et al. 1991), MECP2 a la síndrome de Rett (Amir et al. 1999) o NLGN4 en una família amb 13 afectats d’autisme no sindròmic (Laumonnier et al. 2004). En la majoria dels casos, però, d’herència complexa, s’han hagut de fer servir estudis no paramètrics. El primer estudi de lligament no paramètric fou dut a terme pel consorci internacional IMGSAC (International Molecular Genetic Study of Autism Consortium) l'any 1998. S'hi van obtenir evidències de lligament a les regions 2q i 7q (IMGSAC 1998). Estudis posteriors, tant d'aquest com d'altres consorcis, van descriure altres regions de susceptibilitat: 6q, 15q i 19q (Philippe et al. 1999); 7q i 13q (Barrett et al. 1999); 1p (Risch et al. 1999); 2q, 7q, 16p i 17p (IMGSAC 2001); 2q (Buxbaum et al. 2001); 5q, 7q, 19q i Xq (Liu et al. 2001); 4q, 5q, 11p i 17q (Auranen et al. 2002); 2q, 3p, 7q, 19q i Xq (Shao et al. 2002). En general, es tracta de resultats poc concordants, amb senyals suggestives de lligament pràcticament a tots els cromosomes. Els loci replicats de forma més consistent són el 2q, 7q i 17q (Liu i Takumi 2014) (Figura 3). Aquesta falta de concordança en els resultats es pot atribuir a diferents factors. Que un resultat no es repliqui en una segona mostra no significa que aquest no representi un lligament real, ja que la malaltia pot presentar una gran heterogeneïtat genètica i a més poden haver-hi factors de susceptibilitat d’efecte modest, no detectables per anàlisi de lligament (Freitag et al. 2010). Tampoc cal oblidar la gran heterogeneïtat clínica que solen presentar les col.leccions de pacients TEA, així com el problema de la mida mostral, que ha de ser suficientment gran per permetre la identificació de variants d’efecte modest i discriminar entre els falsos positius i els veritables positius (Bacchelli i Maestrini 2006). Per reduir el problema de l’heterogeneïtat genètica, s’han fet nombrosos estudis de lligament seguint criteris més estrictes d’inclusió de pacients o bé estudiant trets específics o subgrups fenotípics associats amb els TEA (endofenotips). Com a exemple, les regions 7q i 2q han obtingut valors més significatius de lligament en els estudis amb famílies classificades segons trets del llenguatge (Bradford et al. 2001, Buxbaum et al. 2001, Folstein i Mankoski 2000, Liu et al. 2001, Shao et al. 2002), i s’ha identificat un locus de trets quantitatius (QTL, Quantitative Trait Loci) per al retard del llenguatge a la regió 7q34-36 (Alarcon et al. 2002). Els comportaments repetitius s’han associat amb la regió 15q11-13 (Shao et al. 2003) i s’ha descrit el locus 1q relacionat amb els comportaments obsessiu-compulsius (Buxbaum et al. 2004, Silverman et al. 2002). Un estudi més recent, en què subdivideixen la mostra segons sis factors diferents, descriu evidències de lligament entre la regió 19q13.32-33 i els comportaments repetitius, i entre 11q23.1-3 i l’atenció (Liu et al. 2011). Aquests estudis mostren la importància d’un diagnòstic acurat dels endofenotips en la recerca de variants de susceptibilitat, però agreugen el problema de la mida mostral, raó per la qual el poder estadístic de les diferents anàlisis és reduït. Per tractar d’eliminar el problema de la mida mostral en els estudis genètics es va crear el consorci internacional AGP (Autism Genome Project), que inclou bona part dels grups pre-existents, amb clínics i investigadors de més de 50 centres. El consorci va endegar la creació d’una col·lecció de més de 1700 famílies amb fills autistes. L'any 2007 l’AGP va publicar un estudi de lligament en què es van avaluar més de 10.000 marcadors distribuïts per tot el genoma en 1181 famílies múltiplex (amb més d’un fill afectat). El resultat més significatiu va apuntar a la regió cromosòmica 11p12-13. Considerant únicament el fenotip més estricte i les famílies que incloïen almenys una dona amb autisme (FC, Female Containing), 14.

(26) es va obtenir evidència de lligament també també a les regions 5p15.33 i 9p24.1, i a les regions 2q i 7q en el subgrup de població europea de la mostra (Szatmari et al. 2007).. Tot i el major poder estadístic d’aquest estudi, no es van trobar evidències d’un locus “major” de susceptibilitat a l’autisme, l’autism confirmant la teoria que es tracta d’una malaltia amb un elevat grau d’heterogeneïtat genètica.. Figura 3. Idiograma que mostra les regions de lligament resultants dels treballs dels principals consorcis internacionals abans de la creació de l’Autism l’ Genome Project (AGP) (barres blaves): 6q, 15q i 19q (Philippe et al. 1999); 7q i 13q (Barrett et al. 1999); 1999) 1p (Risch et al. 1999); 2q, 7q, 16p i 17p (IMGSAC 2001); 2001) 2q (Buxbaum et al. 2001); 5q, 7q, 19q i Xq (Liu et al. 2001); 4q, 5q, 11p i 17q (Auranen et al. 2002);; 2q, 3p, 7q, 19q i Xq (Shao et al. 2002).. Regions de lligament resultants dels estudis de l’AGP (barres taronges): 5p, 9p i 11p (Szatmari et al. 2007).. Regions de lligament més replicades als diferents estudis (barres verdes): 2q, 7q i 17q (Liu i Takumi 2014).. Estudis de gens candidats Donada la complexitat genètica dels TEA i les diferents hipòtesis sobre el pes que podria tenir cadascuna de les variants nts de susceptibilitat, s’han seguit dues estratègies diferents en l’estudi de gens candidats: (I) reseqüenciació directa dels gens per a la recerca de variants rares d’alta penetrància, i (II) estudis d’associació de tipus cas-control control amb marcadors polimòrfics polimòrfics que cobreixen aquests gens, per detectar variants comunes de susceptibilitat que tindrien un efecte modest sobre el fenotip. D’aquesta manera, en els últims anys s’han analitzat més de 100 gens candidats, tot obtenint alguns resultats positius. Algunss exemples de gens pels quals s’han descrit variants altament penetrants han ha estat descrits anteriorment (pàg. 10), ), com és el cas dels gens codificants per les neuroligines, neuroligines, els més àmpliament estudiats com a candidats (Persico i Napolioni 2013). 2013). Vegem altres exemples a continuació: El gen RELN (OMIM *600514) està situat a la regió 7q22.1, una de les més replicades en els successius estudis de lligament genètic. Codifica Codifica la reelina, una proteïna de la matriu extracel·lular implicada en la migració cel·lular i l'establiment de les connexions neurals. Donades les alteracions estructurals i 15.

(27) funcionals del SNC descrites en pacients autistes (1.3. Fisiopatologia) i la funció d’aquesta proteïna en el desenvolupament del cervell, el gen RELN és un bon candidat per a la recerca de variants de susceptibilitat als TEA. S’han fet diferents estudis d’associació amb polimorfismes d'aquest gen, de tipus cas-control i basats en famílies (prenent com a controls els membres sans de la família de l’afectat). L'any 2001 es va identificar un microsatèl·lit a la regió 5’ del gen (Persico et al. 2001), que més endavant es va associar amb l’autisme mitjançant estudis basats en famílies que van mostrar una transmissió preferencial de l’al·lel més llarg entre els pacients TEA (Zhang et al. 2002). Altres treballs independents donen suport a l'associació entre autisme i RELN (Ashley-Koch et al. 2007, Dutta et al. 2007, Skaar et al. 2005), reforçada també per l'associació de dos SNPs més, un a l’exó 22 i un altre a l’intró 59 del gen (Serajee et al. 2006). MET (OMIM *164860), situat a la regió 7q31.2, codifica el receptor tirosina-cinasa del factor de creixement d’hepatòcits. Tot i que es tracta d’un gen àmpliament estudiat com a oncogen, s’ha considerat un bon candidat per l’autisme perquè participa en el desenvolupament de l’escorça cerebral i l'escorça cerebel·losa (Park et al. 1986, Powell et al. 2001, Streit i Stern 1997), i se li ha atribuït un paper important en la modulació del comportament social (Peng et al. 2013, Sousa et al. 2009). Un estudi d’associació amb polimorfismes d’aquest gen en més de 1200 casos TEA va revelar una forta associació amb un SNP de la regió reguladora a 5’ del gen MET. A més, mitjançant estudis funcionals, es va observar correlació entre l’activitat del promotor i la susceptibilitat a l'autisme (Campbell 2006). Un treball posterior del mateix grup va identificar nivells inferiors d’expressió de MET en cervells post mortem de pacients autistes en relació a cervells d’individus sans (Campbell 2007), tot recolzant les seves primeres troballes. Els gens FOXP2 (OMIM *605317) i CNTNAP2 (OMIM * 604569), ambdós a la regió 7q (7q31.1 i 7q35-36, respectivament) han estat considerats bons candidats per als TEA. Anàlisis de reseqüenciació han revelat mutacions en el gen FOXP2 (Forkhead Box P2) relacionades amb trastorns de desenvolupament del llenguatge a diverses famílies (Lai et al. 2001, MacDermot et al. 2005). FOXP2 codifica un factor de transcripció que regula l’expressió del gen CNTNAP2 (Vernes et al. 2008), que s'ha associat també amb la malaltia. Aquest gen codifica la proteïna associada a contactina 2, que pertany a la mateixa família de les neurexines, comentades anteriorment en aquest treball (pàg. 10). S’han descrit mutacions en homozigosi en aquest gen en una família Amish amb nens que mostraven un fenotip molt greu, amb convulsions i regressió del llenguatge, i trets autistes (Strauss et al. 2006). Diversos estudis donen suport a l'associació de CNTNAP2 amb l'autisme (Alarcon et al. 2008, Arking et al. 2008, Bakkaloglu et al. 2008, Poot et al. 2010). A més, s'ha observat associació entre SNPs d’aquest gen i trastorns específics del llenguatge (Vernes et al. 2008). De totes formes, altres estudis no aconsegueixen replicar aquesta associació (Jonsson et al. 2014, Murdoch et al. 2015, Sampath et al. 2013), i s’han descrit variants del número de còpies (CNVs) que inclouen aquest gen però només en pacients amb esquizofrènia, epilèpsia o TDAH sense trastorns del llenguatge (Elia et al. 2010, Friedman et al. 2008, Mefford et al. 2010). SLC6A4 (OMIM *182138) està ubicat a la regió 17q11.1-q12, també lligada a l’autisme. Codifica el receptor de serotonina 5-HTT, i ha estat objecte d’interès per tres motius principals: (I) l’observació de nivells elevats de serotonina en sang i orina de pacients TEA (Burgess et al. 2006, Cook i Leventhal 1996, Croonenberghs et al. 2000), (II) la resposta d’aquests pacients a tractaments amb inhibidors selectius de la recaptació de serotonina o antagonistes del receptor de serotonina, que redueixen alguns dels comportaments associats a la malaltia, com l’agressivitat, la compulsió o l’autolesió (Nikolov et al. 2006), i (III) estudis de neuroimatge amb tomografia d’emissió de positrons (PET) que mostren una 16.

(28) asimetria anormal en la síntesi de serotonina a l’escorça frontal, temporal i parietal en individus autistes (Chandana et al. 2005). Diversos estudis han detectat associació entre el polimorfisme 5-HTTPR, situat a la regió promotora del gen, i l'autisme (Cook et al. 1997, Coutinho et al. 2004, Cho et al. 2007, McCauley et al. 2004, Sutcliffe et al. 2005). No obstant, molts altres treballs no han obtingut resultats significatius, i una meta-anàlisi recent no va detectar associació amb l’autisme (Huang i Santangelo 2008). El gen del receptor d’oxitocina, OXTR (OMIM *167055) està situat a la regió 3p25.3. Diversos estudis clínics i en models animals apunten a la oxitocina com a una hormona clau en els comportaments repetitius i la interacció social (Green i Hollander 2010). Estudis d’associació amb aquest gen han descrit tant SNPs aïllats com haplotips que confereixen risc als TEA, així com associacions amb el coeficient intel·lectual i amb la puntuació de l’escala de comportaments adaptatius (Jacob et al. 2007, Lerer et al. 2008, Liu et al. 2010, Wu et al. 2005). S'han observat també nivells augmentats de metilació en el gen OXTR en sang i a l'escorça temporal, i una reducció dels nivells d’ARN missatger (ARNm) a l’escorça temporal (Gregory et al. 2009). Tot i que aquí hem donat alguns exemples de casos en què s’han pogut descriure correlacions genètiques amb l’autisme, en general l’estudi de gens candidats ha aportat resultats poc consistents. Els estudis d’associació han donat molt sovint senyals que no s’han pogut replicar posteriorment i, en el cas de les variants rares detectades per seqüenciació, el fet d’haver-les descrit en un petit nombre d’individus fa difícil la seva interpretació en relació al fenotip. Estudis d’associació a escala genòmica (GWAS, Genome-wide association studies) Els estudis d’associació de tipus cas-control poblacionals han estat els més àmpliament utilitzats en l’estudi de malalties complexes. Una de les seves limitacions, però, és la possible estratificació de la mostra, donada la gran mida que aquesta ha de tenir per dotar l’estudi de suficient poder estadístic, i per tant cal seleccionar pacients i controls de la mateixa població i etnicitat. Una altra estratègia, que evita aquest problema, són els estudis d’associació basats en famílies. En general els resultats d'aquests estudis s'analitzen mitjançant tests de desequilibri de transmissió (TDT), que permeten determinar si els progenitors de la família, heterozigots per un polimorfisme concret, transmeten preferencialment un o altre al·lel al seu fill afectat. El primer GWAS en autisme, realitzat amb microsatèl·lits i utilitzant una mostra petita de casos i controls de les illes Faroe, es dugué a terme l'any 2006, i permeté detectar associacions a 2q, 3p, 6q, 15q, 16p i 18q (Lauritsen et al. 2006). La regió genòmica amb una associació més consistent, a 3p25.3, coincideix amb alguns loci identificats anteriorment per anàlisi de lligament (pàg. 14). Dos anys més tard es va anar un pas més enllà, amb un estudi de 500.000 marcadors de tipus SNP en famílies múltiplex amb diagnòstic estricte d’autisme (Arking et al. 2008). En aquest cas cap senyal va superar els llindars de significació a nivell genòmic. Aleshores van analitzar els genotips mitjançant lligament, amb un resultat positiu a la regió 7q35. Finalment, van fer una anàlisi TDT en trios (pare, mare i fill autista) utilitzant marcadors d’aquesta regió, amb una associació, que superava les correccions per tests múltiples, amb un SNP situat al gen CNTNAP2, que hem destacat anteriorment com a candidat per a l'autisme (pàg.15). Aquest resultat es va replicar en una mostra de 1.295 trios.. 17.

Figure

Figura 1. Classificació fenotípica dels Trastorns de l’Espectre Autista (TEA) segons el Manual  Diagnòstic i Estadístic dels Trastorns Mentals, 4a edició revisada (DSM-IV TR)

Figura 1.

Classificació fenotípica dels Trastorns de l’Espectre Autista (TEA) segons el Manual Diagnòstic i Estadístic dels Trastorns Mentals, 4a edició revisada (DSM-IV TR) p.18
Figura 2. Concordança entre bessons monozigòtics (MZ) i dizigòtics (DZ) en els diferents fenotips relacionats amb els Trastorns de l’Espectre Autista

Figura 2.

Concordança entre bessons monozigòtics (MZ) i dizigòtics (DZ) en els diferents fenotips relacionats amb els Trastorns de l’Espectre Autista p.21
Figura 4. Representació esquemàtica dels models poligènics i mendelià que es postulen per als TEA, amb evidències a favor i en contra de cadascun d'ells

Figura 4.

Representació esquemàtica dels models poligènics i mendelià que es postulen per als TEA, amb evidències a favor i en contra de cadascun d'ells p.36
Figura 7. Estructura, biogènesi i funció dels microRNAs. L’RNA-polimerasa II (RNA Pol II) transcriu el miRNA en el

Figura 7.

Estructura, biogènesi i funció dels microRNAs. L’RNA-polimerasa II (RNA Pol II) transcriu el miRNA en el p.40
Figura 9. Estructura de la família MT_160, on s’indiquen els genotips per a la mutació a YWHAZ en els casos en què s’ha pogut determinar

Figura 9.

Estructura de la família MT_160, on s’indiquen els genotips per a la mutació a YWHAZ en els casos en què s’ha pogut determinar p.162
Figura 11. Sensograma dels experiments de ressonància superficial de plasmons (RSP), on s’indiquen les unitats de resposta (UR) per unitat de temps en segons (Temps (s))

Figura 11.

Sensograma dels experiments de ressonància superficial de plasmons (RSP), on s’indiquen les unitats de resposta (UR) per unitat de temps en segons (Temps (s)) p.164
Figura 12. Fusió dels cromatogrames resultants de la injecció de l’homodímer MBP-14-3-3 ε: ε (verd), l’homodímer 14-3-3ζ_WT:ζ_WT (lila), i els heterodímers MBP-14-3-3 ε:14-3-3ζ_WT (blau fosc) i MBP-14-3-3 ε:14-3-3ζ_mut (blau clar) a la columna de filtració

Figura 12.

Fusió dels cromatogrames resultants de la injecció de l’homodímer MBP-14-3-3 ε: ε (verd), l’homodímer 14-3-3ζ_WT:ζ_WT (lila), i els heterodímers MBP-14-3-3 ε:14-3-3ζ_WT (blau fosc) i MBP-14-3-3 ε:14-3-3ζ_mut (blau clar) a la columna de filtració p.165
Figura 14.mutacional i la discapacitat cognitiva més severa, i el trastorn depressiu (TD) associats amb la menor càrrega mutacional i discapacitat cognitiva, amb la discapacitat intel·lectual (DI) associada amb la major càrrega simplificada de la hipotètic

Figura 14.mutacional

i la discapacitat cognitiva més severa, i el trastorn depressiu (TD) associats amb la menor càrrega mutacional i discapacitat cognitiva, amb la discapacitat intel·lectual (DI) associada amb la major càrrega simplificada de la hipotètic p.174
Figura 15. Relació entre la freqüència al·lèlica i la mida de l’efecte de les variants en els Trastorns de l’Espectre Autista (TEA)

Figura 15.

Relació entre la freqüència al·lèlica i la mida de l’efecte de les variants en els Trastorns de l’Espectre Autista (TEA) p.175
Figura 16. En famílies amb més d’un fill afectat de TEA, les variants rares heretades compartides pels germans afectats són les que amb més probabilitat poden tenir relació amb el fenotip

Figura 16.

En famílies amb més d’un fill afectat de TEA, les variants rares heretades compartides pels germans afectats són les que amb més probabilitat poden tenir relació amb el fenotip p.179
Figura 17. EL problema de l’heretabilitat perduda als Trastorns de l’Espectre Autista (TEA)

Figura 17.

EL problema de l’heretabilitat perduda als Trastorns de l’Espectre Autista (TEA) p.188

References

Related subjects :