Caracterización de los ADNc completos de los genes de expansina

Inicialmente se realizaron búsquedas de los ADNc completos de los genes

FaEXP1, FaEXP4, FaEXP5 y FaEXP6 en una biblioteca de ADNc obtenida a partir de

frutillas maduras. De los clones positivos obtenidos luego de dos rondas de hibridación y purificación para cada uno de estos genes, sólo se obtuvo el ADNc completo correspondiente a FaEXP4 (ver más adelante). Por lo tanto, se decidió obtener los ADNc completos de FaEXP1, FaEXP5 y FaEXP6 usando la técnica de RACE. De esta manera se obtuvo el ADNc completo de FaEXP1 y FaEXP5 y la zona 3’-UTR de FaEXP6. El extremo 5’-UTR faltante de la secuencia del ADNc completo de FaEXP6 fue obtenido a través de una colaboración que se realizó con el laboratorio del Prof. Dr. Victoriano Valpuesta Fernández de la Universidad de Málaga, España. En dicho laboratorio cuentan con una colección de ESTs de frutos verdes y de frutos maduros de Fragaria x ananassa (resultados no publicados) y mediante una búsqueda en su base de datos se obtuvo un clon que contenía la zona 5’ UTR de FaEXP6 (ver más adelante) aislado a partir de frutos verdes.

FaEXP1

Mediante el uso de un kit (SMART RACE cDNA Amplification kit; Clontech) se obtuvo la secuencia completa del gen FaEXP1 de la cual solo se conocía un fragmento de 501 pb (Rose y col., 1997) contenido en su zona codificante. La secuencia completa obtenida se muestra en la Figura 11 A. La zona resaltada con fondo negro corresponde al marco abierto de lectura (ORF: Open Reading Frame) predicho por el programa EditSeq (DNASTAR). De acuerdo a esto, el ADNc del gen

FaEXP1 posee una longitud de 1278 pb, de las cuales la zona 5’-UTR tiene 55 pb, el

ORF posee 783 pb y la zona 3’-UTR comprende 440 pb, sin considerar la cola de poli-A.

En la Figura 11 B se muestra la secuencia predicha de la proteína FaEXP1. Usando los programas SignalP y TargetP (ver Mat. y Mét) se predijo un péptido señal de 23 aminoácidos (resaltado con fondo negro en la Figura 11 B) que dirigiría la proteína hacia la ruta secretoria, con destino a la pared celular. La proteína precursora tendría 260 aminoácidos y una masa molecular de 27,9 kDa, mientras que la proteína madura estaría formada por 237 aminoácidos y su masa molecular sería de 25,5 kDa (Tabla III).

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FaEXP4

Previamente se conocía un fragmento de 487 pb de la secuencia codificante de FaEXP4 (Harrison y col., 2001). De la búsqueda en la biblioteca de ADNc se obtuvieron cinco clones positivos que fueron enviados para ser secuenciados; obtenidas las secuencias se concluyó que todos correspondían al ADNc completo de

FaEXP4. La secuencia completa obtenida se muestra en la Figura 12 A, junto con el

ORF predicho. El ADNc de este gen cuenta con 1338 pb, una zona 5’-UTR que incluye tan solo 14 pb, el ORF 756 pb y el 3´-UTR 569 pb.

Usando los programas SignalP y TargetP se predijo un péptido señal de 22 aminoácidos, resaltado en fondo negro en la Figura 12 B, que también dirigiría la proteína generada a la ruta secretoria. Se muestra en dicha figura la secuencia de la proteína FaEXP4 predicha a partir de la secuencia de nucleótidos. De esta manera, la proteína precursora tendría 251 aminoácidos y una masa molecular de 26,6 kDa, mientras que a la proteína madura le correspondería 229 aminoácidos y 24,4 kDa (Tabla III).

Figura 11: ADNc completo de FaEXP1. A: Secuencia de nucleótidos, se muestra en fondo negro el

ORF predicho por el programa EditSeq. B: traducción del ORF mostrado en A, con fondo negro se muestra el péptido señal predicho por el programa SignalP.

A

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FaEXP5

En el caso del gen FaEXP5, previamente se había descrito un fragmento de 488 pb de su secuencia codificante (Harrison y col., 2001). Al igual que lo mencionado anteriormente para FaExp1, se utilizó el kit “SMART RACE” y se logró clonar la secuencia completa de su ADNc (Figura 13). La secuencia completa obtenida para este ADNc de 1154 pb se muestra en la Figura 13 A y se resalta en fondo negro el ORF predicho de 753 pb; la zona 5’-UTR presenta 94 pb y la 3’-UTR 307 pb.

En la Figura 13 B se resalta el péptido señal de 21 aminoácidos predicho por SignalP que, de acuerdo a lo indicado por el programa TargetP, dirigiría a la proteína a la ruta secretoria. La proteína precursora en este caso tendría 250 aminoácidos y una masa molecular de 26,7 kDa, correspondiendo a la proteína madura 229 aminoácidos y 24,5 kDa.

Figura 12: ADNc completo de FaEXP4. A: Secuencia de nucleótidos, se muestra en fondo negro el

ORF predicho por el programa EditSeq. B: traducción del ORF mostrado en A, con fondo negro se muestra el péptido señal predicho por el programa SignalP.

A

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FaEXP6

Para este gen se conocía previamente un fragmento de su secuencia codificante de 494 pb (Harrison y col., 2001). La secuencia del ADNc completo del gen de FaEXP6 contiene 1175 pb (Figura 14 A), un ORF de 780 pb, una zona 5’- UTR de 23 pb y una región 3’-UTR de 372 pb.

Al igual que lo observado en las demás proteínas, se predijo un péptido señal que dirige la proteína a la ruta secretoria, y que en este caso sería de 22 aminoácidos (Figura 14 B). La proteína precursora tendría 259 aminoácidos y una masa de 27,8 kDa, y la proteína FaEXP6 madura, 237 aminoácidos y una masa de 25,6 kDa.

Figura 13: ADNc completo de FaEXP5. A: Secuencia de nucleótidos; se muestra en fondo negro el

ORF predicho por el programa EditSeq. B: traducción del ORF mostrado en A, con fondo negro se muestra el péptido señal predicho por el programa SignalP.

A

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 En la Tabla III se resumen las características de los ADNc obtenidos y las del ADNc completo de FaEXP2, que era el único conocido al inicio de esta tesis (Civello y col., 1999). También se analizó la secuencia predicha de la proteína FaEXP2 con los programas SignalP y TargetP y se predijo un péptido señal de 25 aminoácidos que también dirigiría a la proteína a la ruta secretoria. En este caso se predice una proteína madura de 24,2 kDa y 228 aminoácidos.

En la Figura 15 se muestra un alineamiento de las proteínas completas predichas. Al igual que en la Figura 7, se indican con flechas los residuos de C y W conservados y se recuadra el motivo HFD característico de las expansinas pertenecientes a las familias EXPA y EXPB.

Figura 14: ADNc completo de FaEXP6. A: Secuencia de nucleótidos, se muestra en fondo negro el

ORF predicho por el programa EditSeq. B: traducción del ORF mostrado en A, con fondo negro se muestra el péptido señal predicho por el programa SignalP.

A

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 Tabla III

Características de las expansinas en estudio

Gen ADNc a _ORF b _SignalP c Proteína

Madura b TargetP d FaEXP1 1278 pb 260 aa 27,9 kDa 23 aa 25,5 kDa RS FaEXP2 1199 pb 253 aa 26,9 kDa 25 aa 24,2 kDa RS FaEXP4 1338 pb 251 aa 26,6 kDa 22 aa 24,4 kDa RS FaEXP5 1154 pb 250 aa 26,7 kDa 21 aa 24,5 kDa RS FaEXP6 1175 pb 259 aa 27,8 kDa 22 aa 25,6 kDa RS

a _{longitud en pares de base del ADNc completo, sin considerar la cola de poliA.}

b _{cantidad de aminoácidos en el ORF, masa molecular de la proteína precursora y de la proteína madura} en kDa, predichos con el programa EditSeq (DNASTAR).

c _{tamaño del péptido señal predicho por el programa SignalP.}

d _{RS: ruta secretoria; destino de la proteína madura predicho por el programa TargetP.}

Figura 15: Alineamiento de las secuencias de proteínas predichas de las expansinas en estudio.

Se indican con flechas azules los 8 residuos de cisteína (C) y con flechas rojas los 5 residuos de triptófano (W) conservados en la familia de las D-expansinas. También se recuadra en color naranja el motivo HFD conservado en las familias de expansinas EXPA y EXPB.

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