Caracterización bioquímica de wt-procirsina recombinante

Actividad proteolítica de wt-procirsina recombinante sobre diferentes sustratos modelo

La actividad proteolítica de wt-procirsina recombinante purificada se testeó a pH 4,0 y 37 °C, contra varios sustratos sintéticos fluorogénicos considerados sustratos modelos para la actividad de diferentes PAs. La velocidad de hidrólisis se monitoreó por incremento en la intensidad de fluorescencia (excitación/emisión péptidos fluorogénicosMCA/DNP: 328/393 nm;

excitación/emisión péptidos fluorogénicos EDANS/DABCYL: 335/490 nm) por un período de 600 seg (Fig. 11) en un espectrofluorómetro Jobin Yvon FluoroMax-3 Spectrofluorometer (Horiba). Los sustratos testeados en concentración 2 μM en la mezcla de reacción y relación proteína:sustrato entre 0,9:1 y 1,8:1 (v/v), se enumeran en la Tabla 13.

Sustrato Secuencia Buffer de reacción

sustrato de PAs típicas MCA-KKPAEFFALK(DNP) HOAc / NaOAc 50 mM, NaCl

0,1 M

sustrato para CDR1 MCA-KLHPEVLFVLEK(DNP) HOAc / NaOAc 50 mM, NaCl

0,1 M, DMSO 8% (v/v)

sustrato 1 de PA atípicas MCA-KKLADVVNALEKK(DNP) HOAc / NaOAc 50 mM, NaCl

0,1 M, DMSO 8% (v/v)

sustrato para BACE 1 MCA-KSEVNLDAEFK(DNP) HOAc / NaOAc 50 mM, NaCl

0,1 M, DMSO 8% (v/v) sustrato 1 de la proteasa

de HIV RE(EDANS)SQNYPIVQK(DABCYL)R

HOAc / NaOAc 50 mM, NaCl 0,1 M, DMSO 9,6% (v/v); sustrato 1 de Renina RE(EDANS)IHPFHLVIHTK(DABCYL)R HOAc / NaOAc 50 mM, NaCl

0,1 M, DMSO 9,6% (v/v)

Tabla 13. Sustratos sintéticos evaluados en la determinación de actividad proteolítica de procirsina.

58 Fig. 11. Fundamento de la medida de actividad proteolítica con los sustratos empleados.

Determinación del perfil de pH y temperatura

El perfil de pH característico de la actividad endopeptidásica de las fracciones purificadas de wt-procirsina se determinó utilizando el sustrato fluorogénico para PAs típicas MCA-KKPAEFFALK(DNP) en concentración 2 μM en la mezcla de reacción.

El rango de pH ensayado fue 2,25−7,0 en los siguientes buffers: ácido cítrico-citrato de sodio 50 mM (pH 2,25 y 2,5); ácido acético-acetato de sodio 50 mM (pH 3,5; 3,75; 4,0; 4,5; 5,0; 6,0); Tris-HCl 50 mM (pH 7,0), conteniendo en todos los casos NaCl 100 mM. El aumento en la intensidad de fluorescencia producido por la hidrólisis del sustrato se monitoreó espectrofluorométricamente (excitación/emisión: 328/393 nm) durante 10 min.

El efecto de la temperatura sobre la actividad proteolítica de wt-procirsina recombinante se estudió mediante la preincubación de la enzima en buffer ácido acético-acetato de sodio 50 mM, NaCl 100 mM (pH 4,0) a diferentes temperaturas entre 10 y 65 °C por el lapso de 10 min. Transcurrido el tiempo de incubación se agregó el sustrato fluorogénico, se mezcló por inversión rápida y se siguió la intensidad de fluorescencia emitida a 393 nm durante 10 min por excitación del fluoróforo a 328 nm.

59 Ensayos de inhibición

Con el fin de establecer el mecanismo proteolítico de las enzimas contenidas en las diferentes preparaciones enzimáticas se emplearon inhibidores específicos de grupo (Dunn, 2001) sobre la actividad endopeptidásica empleando el sustrato fluorogénico para PAs típicas.

Las muestras de proteínas se preincubaron durante 6 min a temperatura ambiente con cada uno de los siguientes inhibidores: pepstatina A (1 μM, inhibidor de aspartilpeptidasas), E-64 (10 μM, inhibidor de cisteinpeptidasas), Pefabloc (1 mM, inhibidores de serinpeptidasas), EDTA (5 μM, inhibidor de metalopeptidasas), amastatina (10 μM, inhibidor de aminopeptidasas) y DTT (1 mM, reductor de puentes disulfuro). Finalizado el tiempo de incubación, se agregó el sustrato, en proporción 3 veces mayor a la masa de proteínas, y se determinó la actividad endopeptidásica de la manera indicada en el inciso preanterior. En cada caso se incluyó como control el solvente en que el inhibidor se encontraba disuelto.

Determinación de parámetros cinéticos

Para los estudios cinéticos a 37 °C se usó el péptido sintético de PAs típicas ya descripto, en un rango de concentraciones entre 0,5 y 5 μM en buffer ácido acético-acetato de sodio 50 mM de pH 4,0 conteniendo NaCl 100 mM. La concentración de enzima utilizada en el ensayo se determinó por titulación del sitio activo de wt-procirsina purificada con pepstatina A. Los ensayos se llevaron a cabo con el mismo espectrofluorómetro y el mismo programa que en los incisos anteriores, durante 600 seg.

La relación entre la variación de fluorescencia y la concentración de sustrato peptídico hidrolizado en la reacción se determinó por medición del cambio total de fluorescencia ocurrido en la hidrólisis completa del mismo por parte de la enzima pepsina.

Los parámetros cinéticos VMAX y KM se calcularon a partir del gráfico Lineweaver-Burk obtenido con el módulo de cinética del programa Sigma Plot 10.0 para Windows (SPSS Inc.).

Titulación del sitio activo con pepstatina A

Para determinar la proporción de moléculas de enzima activas, se empleó una modificación del método descripto por Salvesen y Nagase (Salvesen and Nagase, 2001). Muestras de

60 wt-procirsina purificada se incubaron durante 6 min a 37 °C en presencia de cantidades

crecientes del inhibidor específico de aspartilpeptidasas típicas pepstatina A (0 a 0,5 pmoles), con el que forman un complejo en relación 1:1. Luego, se determinó la actividad residual sobre el sustrato de PAs típicas a pH 4,0 como se indicó previamente y los valores obtenidos se graficaron en función de los pmoles de pepstatina A. La abscisa al origen de este gráfico indicó el número de picomoles de enzima cuando la actividad se inhibió completamente.

Determinación de la especificidad de sustrato sobre la cadena β de la insulina oxidada

La cadena β de la insulina oxidada (Sigma) en una concentración de 1 mg/ml se incubó con wt-procirsina recombinante purificada (relación enzima:sustrato 1:100) en buffer ácido acético-acetato de sodio 0,1 mM de pH 4,0. Transcurrida la digestión ON a 37 °C, el sobrenadante de la mezcla de reacción se centrifugó durante 6 min a 20000 × g y los fragmentos de digestión se separaron por cromatografía en fase reversa como se describe en la Técnica nº12. Los dos péptidos mayoritarios aislados se sometieron a identificación por LC/MS/MS en un equipo 4000 QTRAP (Applied Biosystems) del Servicio de la Unidad de Proteómica del Centro de Neurosciencias y Biología Celular de la Universidad de Coimbra.

Digestión de -caseína

La -caseína (0,3 mg/ml) se incubó en buffer ácido acético-acetato de sodio 50 mM (pH 5,5) con wt-procirsina en una relación en masa proteína:sustrato de 1:250. La reacción de digestión procedió a 37 °C durante 18 hs y el producto resultante se analizó luego por SDS-PAGE y tinción con Coomasie como se indica en las Técnicas nº14 y nº15. Se incluyó también un control sin agregado de wt-procirsina en la mezcla de reacción.