Clonado de ADNc y análisis de la secuencia

Con el fin de identificar y caracterizar posteriormente las proteasas aspárticas típicas de Cirsium vulgare, se comenzó por sintetizar el ADNc de preprocirsina usando ARN total aislado de pimpollos. Luego, el híbrido ADNc-ARN se usó como molde en la reacción de PCR con cebadores diseñados específicamente para regiones conservadas de los extremos 5´ y 3´del marco de lectura abierto (ORF) de PAs de plantas. El producto amplificado obtenido, de 1530 pb, se clonó y varios clones conteniendo el inserto deseado se secuenciaron en forma automática (Fig. 12). Este análisis resultó en la identificación de al menos cuatro secuencias de aminoácidos diferentes (Anexo 1) exhibiendo altos niveles de identidad de secuencia entre ellas y con otras secuencias de PAs típicas de plantas disponibles en bases de datos públicas, sugiriendo claramente la presencia de varias PAs en flores de C. vulgare. Una de estas secuencias de ADNc se seleccionó para ser posteriormente caracterizada. Su secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica que de ella se deduce se muestran en la Fig. 13 (número de acceso GenBank: JN703462).

63 63

Clonado de preprocirsina

Fig. 12. Amplificación y clonado de la secuencia correspondiente al marco de lectura abierto de preprocirsina. La primera cadena de ADNc se sintetizó a partir del ARN total aislado de flores inmaduras de C. vulgare y se utilizó como molde en la reacción de amplificación (PCR) con cebadores específicamente diseñados para los extremos 5´ y 3´ altamente conservados en las secuencias codificantes de PAs. El producto de amplificación obtenido se clonó y secuenció en forma automática. (A) Análisis de la extracción de ARN total por electroforesis en gel de agarosa (1%): Calle MW, marcadores de masas moleculares de ADN de 1 kb; Calles 1 y 2, muestras del ARN total de C. vulgare aislado. (B) Análisis electroforético en gel de agarosa (1%) del producto amplificado mediante RT-PCR: Calle MW, marcadores de masas moleculares de ADN 1 kb; Calle 1, ADNc completo de 1,5 kb. (C) Análisis por restricción de clones transformados con el plásmido pGEM-preproCV: Calles MW, marcadores de masas moleculares de ADN de 1 kb; Calles 1 a 9, plásmido pGEM-preproCV aislado de los clones 1 a 9 respectivamente, y digeridos con la enzima de restricción StyI.

64 64

Este producto proteico, llamado preprocirsina, codifica para una preproenzima de 509 residuos con un péptido señal hidrofóbico de 24 aminoácidos predicho utilizando el programa SignalP 4.0 (Petersen et al., 2011), un prosegmento de 44 residuos, y un polipéptido de 441 aminoácidos de largo interrumpido por 105 residuos correspondientes al dominio PSI. La preproenzima tiene una masa molecular predicha de 55 kDa con un pI teórico de 5,3. La secuencia de aminoácidos deducida del ADNc, muestra la estructura primaria característica de las proteasas aspárticas típicas de plantas, además de las dos tríadas catalíticas altamente conservadas (DTG 103-105 y DTG 290-292) y un residuo tirosina en la posición 147 (los cuales se corresponden a los motivos DTG 32-34, DTG 215-217 y el residuo Y75, respectivamente, usando la numeración de la pepsina como referencia).

Asimismo, fueron predichos dos sitios de N-glicosilación conservados en varias PAs típicas de plantas (Domingos et al., 2000; Vieira et al., 2001) mediante el programa NetNGlyc (Blom et al., 2004) en los residuos N139 (motivo NGT) y N400 (motivo NET), este último en el dominio PSI.

Cuando se comparó la secuencia aminoacídica de preprocirsina con la de otros precursores de PAs de plantas, ésta mostró un elevado grado de similitud con cyprosina B (CAA57510) proveniente de Cynara cardunculus (identidad: 95%, positivos: 98%), cenprosina (CAA70340) de Centaurea calcitrapa (identidad: 94%, positivos: 97%), la PA de Helianthus annuus (BAA76870, identidad: 83%, positivos: 92%), cardosina A (AJ132884) y cardosina B (AJ237674) de C. cardunculus (identidad: 75%, positivos: 83% and 85%, respectivamente) y fitepsina (X56136) de Hordeum vulgare (identidad: 71%, positivos: 84%) perteneciendo todas estas peptidasas a la familia A1.

La elevada similitud de secuencia entre el precursor de cirsina y el de cyprosina se muestra en la Fig. 14, en donde se puede observar que la mayoría de las diferencias de aminoácidos entre ambas secuencias se hallan en los residuos que conforman el péptido señal, el prosegmento y el dominio PSI; mientras que únicamente 5 residuos localizados en las secuencias correspondientes a los dominios N- y C- terminales de las proteínas maduras, son diferentes. Notablemente, de manera mayoritaria, estas diferencias corresponden a sustituciones conservativas sugiriendo que cirsina y cyprosina están estrechamente relacionadas.

65 65

Secuencia de preprocirsina

Fig. 13. ADNc que codifica para la forma completa de cirsina (preprocirsina) y su secuencia aminoacídica derivada. Secuencias nucleotídica y aminoacídica traducidas de preprocirsina,

se encuentran indicadas las regiones correspondientes a: péptido señal N-terminal (púrpura); prosegmento (celeste) e inserto específico de planta (naranja). Los sitios putativos de glicosilación se especifican mediante un círculo y las tríadas catalíticas se muestran en rojo y recuadradas. La secuencia del ADNc de preprocirsina ha sido incorporada en la base de datos GenBank bajo el número de acceso JN703462.

66 66

Alineamiento de las secuencias de los precursores de cirsina y cyprosina

Fig. 14. Alineamiento de las secuencias aminoacídicas de los precursores de cirsina y de cyprosina (número de acceso: Q39476). Las regiones correspondientes al péptido señal del

N-terminal ( ), el prosegmento ( ) y el inserto específico de planta ( ) están indicadas por flechas sobre las respectivas secuencias. Los sitios putativos de glicosilación se especifican mediante un círculo y las tríadas catalíticas se hallan recuadradas. Los residuos azules representan sustituciones conservativas entre ambas secuencias y los rojos, aquellas sustituciones semi-conservativas.

II. Análisis filogenético

Un análisis filogenético (Fig. 15) muestra que procirsina comparte un grupo o “cluster” con las PAs de diversos organismos tales como C. cardunculus, N. tabacum, P. trichocarpa, R.comunis y G. max. Muchas de las proteínas recuperadas en este análisis son PAs de Tracheophyta con muy pocas pertenecientes a Bryophyta. Como se observa en la Fig. 15 B, procyprosina B se muestra como el homólogo más próximo de procirsina.

67 67

68 68

Fig. 15. Análisis filogenético de proteínas homólogas cercanas a procirsina. El árbol

filogenético se obtuvo por cálculo de probabilidad máxima usando el programa PhyMl tal y como se detalla en Materiales y Métodos―Procirsina. Las diferentes proteínas en el árbol están indicadas con el correspondiente número de identificación del NCBI (National Center for Biotechnology Information), seguido por los nombres del género y de la especie. Procirsina está indicada con un punto rojo y procyprosina B con un punto amarillo, mientras que la proteína con estructura cristalográfica conocida (código PDB: 1qdm) correspondiente a H. vulgare, se muestra mediante un punto azul.

69 69