El aislamiento de genes R, el análisis de su estructura general y el hallazgo de dominios específicos conservados, sentaron las bases para avanzar en la caracterización de las funciones biológicas y de los procesos que dirigen la evolución molecular de estos genes; al tiempo que permitieron el desarrollo de la técnica RGA orientada a la caracterización de genes análogos en otras especies de las plantas. Aunque los primeros genes R se aislaron desde arabidopsis, tomate, tabaco y arroz, el surgimiento de la nueva metodología permitió la extensión a otras especies de plantas cultivables como por ejemplo trigo, cebada, avena, soja, garbanzo, maíz y girasol; y, particularmente, aceleró el inicio del estudio de genes análogos en especies leñosas. Entre estas últimas, la técnica RGA ha sido empleada con éxito en el aislamiento de genes candidatos en un híbrido de Poncirus trifoliata y Citrus grandis (Deng et al., 2000), en híbridos de Vitis vinifera L. y Muscadinia rotundifolia (Donald et al., 2002), en Pinus monticola Dougl. ex. D. Don. (Liu y Ekramoddoullah, 2003 y 2007), en Rosa roxburghii Tratt (Xu et al., 2005), en Carica papaya L. y Vasconcellea cauliflora Jacq. A. DC (De Paiva Rosa Amaral et al., 2006), en Pinus lambertiana (Jermstad et al., 2006) y en Prunus (Bliss et al., 2002; Gillen y Bliss, 2005; Soriano et al., 2005). Y, bajo la forma de un sistema de marcadores moleculares multilocus, en la caracterización genética de Pinus oocarpa (Diaz y Ferrer, 2003). En la gran mayoría de los casos orientados al aislamiento de genes candidatos se cuenta con patosistemas conocidos, es decir sistemas definidos de huésped y patógeno, y con información sobre la variación genética de la resistencia y sus formas de herencia en la especie en estudio.
En el caso del mal del ciprés el desconocimiento de la etiología retrasó la investigación de la variación genética de la especie en relación a la afección. En este contexto, el empleo de la técnica RGA como un sistema de marcadores multilocus se consideró una de las alternativas más apropiadas para iniciar la caracterización genética de grupos de plantas asintomáticas y sintomáticas para mal del ciprés. Todos los primers empleados, seleccionados por su frecuencia de uso, su reporte en diversas especies de plantas y un diseño basado en las secuencias
nucleotídicas de diferentes dominios de genes R (Anexo 6), fueron efectivos en la amplificación de DNA total proveniente de A. chilensis.
El número de fragmentos amplificados reproducibles obtenido, para cada combinación de primers, fue similar o inferior al reportado en la bibliografía para otras especies de plantas (Tabla III-8). Sin embargo, las comparaciones deben ser analizadas considerando la distancia genética que existe entre las especies sobre las cuales han sido diseñados los primers y aquellas en las que se aplican, las condiciones en las que se realizan las amplificaciones (temperatura de annealing, concentración final de magnesio, etc), los métodos de separación (geles de agarosa o poliacrilamida), la detección de los fragmentos amplificados (bromuro de etidio, tinción con plata, fluorescencia), la metodología empleada en la normalización y reproducibilidad de los fragmentos obtenidos, y la forma en que estos fragmentos son reportados (fragmentos detectados, fragmentos reproducibles, fragmentos polimórficos). De los últimos dos aspectos, el primero no se incluye generalmente en las publicaciones científicas que emplean la técnica
RGA; en tanto que para el segundo, los reportes son muchas veces ambiguos, no se indica si se informan fragmentos totales o sólo los polimórficos.
Para la combinación S1/AS1 la información disponible es escasa, con pocas referencias del número de fragmentos obtenidos o reportes de valores promediados combinando datos desde diferentes pares de primers (Tabla III-8). El valor obtenido en este trabajo para A. chilensis es superior a lo reportado en la bibliografía. Una situación similar se da para la combinación Ptokin3_4, aunque el valor para A. chilensis es del orden del reportado como promedio entre pares de primers (Tabla III-8).
Para las combinaciones XLRR y Ptokin1_2 la información es más abundante y permite una mejor comparación con los valores obtenidos en este trabajo. La gran mayoría de los datos disponibles en la bibliografía, para ambas combinaciones, corresponde a cultivos como arroz, trigo o cebada; siendo el número de fragmentos reportados mayor que el obtenido para A. chilensis (Tabla III-8). La distancia genética entre estas especies cultivadas, A. chilensis y aquellas sobre las que se diseñaron los primers podría explicar parte de las diferencias observadas. En el caso de arroz, trigo o cebada, el número de fragmentos amplificados informados varía en función del total de variedades, cultivares o líneas analizadas; señalando la influencia del mejoramiento genético en la variabilidad detectada (Tabla III-8).
% de MgCl2 Temp Bandasa
polimorfismo
Variedades o
Poblacionesb Especie (mM)c (ºC)d Separación Detección Cita
19(15) 78.9 2 Austrocedrus chilensis 2 43.5 poliacrilamida fluorescencia Este trabajo
3 3 Tomate (Lycopersicon esculentum) 1.5 60 agarosa BrEt Ohmori et al., 1998
(2.9) 2 Tomate (Lycopersicon esculentum y L. hirsutum) 5 50 poliacrilamida plata Foolad et al., 2002 S1/AS1
10 2 Tomate (Lycopersicon esculentum y L. hirsutum) 5 50 poliacrilamida plata Zhang et al., 2002
13(11) 84.6 2 Austrocedrus chilensis 2 43.5 poliacrilamida fluorescencia Este trabajo
60(40) 66.7 41 Arroz (Oryza sativa) 5 45 poliacrilamida plata Wang et al., 2000
91(27) 29.7 12 Arroz ( Oryza sativa) 5 45 poliacrilamida plata Chen et al., 1998
80(32) 40.0 23 Cebada (Hordeum vulgare) 5 45 poliacrilamida plata Chen et al., 1998
38(6) 15.8 44 Trigo (Titricum durum y T. Aestivum) 5 45 poliacrilamida plata Chen et al., 1998
34 10 Pino (Pinus oocarpa) 1.5 45 poliacrilamida plata Diaz y Ferrer, 2003
6.5 2 Frambuesa (Rubus sp.) 2.5 45 agarosa BrEt Pattison et al., 2007
(2.9) 2 Tomate (Lycopersicon esculentum y L. hirsutum) 5 50 poliacrilamida plata Foolad et al., 2002 10 2 Tomate (Lycopersicon esculentum y L. hirsutum) 5 50 poliacrilamida plata Zhang et al., 2002 XLRR
37.1 2 Trigo (Titricum sp.) 2 45 poliacrilamida plata Fayyaz et al., 2007
15(11) 73.3 2 Austrocedrus chilensis 2.5 45 poliacrilamida fluorescencia Este trabajo
51(38) 74.5 41 Arroz (Oryza sativa) 5 45 poliacrilamida plata Wang et al., 2000
90(32) 35.6 12 Arroz ( Oryza sativa) 5 45 poliacrilamida plata Chen et al., 1998
73(35) 47.9 23 Cebada (Hordeum vulgare) 5 45 poliacrilamida plata Chen et al., 1998
97(38) 39.2 44 Trigo (Titricum durum y T. Aestivum) 5 45 poliacrilamida plata Chen et al., 1998 27-55 10, 4, 2, 5 2, 2, 2 Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum Titricum sp., Hordeum sp., Zea mays, L.esculentum, 5 45 poliacrilamida fluorescencia Cheng et al., 2005
(13.25) 10 Pinus oocarpa 1.5 45 poliacrilamida plata Diaz y Ferrer, 2003
6.5 2 Frambuesa (Rubus sp.) 2.5 45 agarosa BrEt Pattison et al., 2007
(2.9) 2 Tomate (Lycopersicon esculentum y L. hirsutum) 5 50 poliacrilamida plata Foolad et al., 2002 10 2 Tomate (Lycopersicon esculentum y L. hirsutum) 5 50 poliacrilamida plata Zhang et al., 2002 Ptokin1_2
37.1 2 Trigo (Titricum sp.) 2 45 poliacrilamida plata Fayyaz et al., 2007
7(6) 85.7 2 Austrocedrus chilensis 2.5 45 poliacrilamida fluorescencia Este trabajo (2.9) 2 Tomate (Lycopersicon esculentum y L. hirsutum) 5 50 poliacrilamida plata Foolad et al., 2002 Ptokin3_4
10 2 Tomate (Lycopersicon esculentum y L. hirsutum) 5 50 poliacrilamida plata Zhang et al., 2002
Tabla III-8: Número de bandas, porcentaje de polimorfismo, variedades o poblaciones, especies y condiciones de amplificación, separación y detección reportadas para las combinaciones de primers utilizadas en la caracterización genética de A. chilensis mediante RGA. a número de bandas totales, entre paréntesis número de bandas polimórficas, valores
subrayados indican reporte según promedio combinando datos desde diferentes pares de primers. bnúmero de variedades, cultivares, líneas o poblaciones analizadas. c concentración de
Dentro de la escasa disponibilidad de datos sobre el número de fragmentos amplificados en especies leñosas, y más específicamente en coníferas, Diaz y Ferrer (2003) reportan entre 16 y 34 fragmentos/primer en Pinus oocarpa. El número máximo (34) corresponde a la combinación XLRR, mientras que no se específica el valor exacto para Ptokin1_2. En ambos casos el número de fragmentos obtenido en A. chilensis es menor que para P. oocarpa (Tabla III-8), las diferencias podrían deberse a modificaciones en las secuencias nucleotídicas de los correspondientes dominios, a las diferencias en la metodología empleada para normalizar los datos y determinar la reproducibilidad de los fragmentos amplificados o al número de poblaciones estudiadas y la distancia geográfica entre las mismas. Las combinaciones Ptokin3_4 y S1/AS1 no fueron empleadas en P. oocarpa.
El porcentaje de polimorfismo en A. chilensis es, contrariamente a lo que ocurre con el número de fragmentos, mayor que en el resto de las especies reportadas. Cuando se consideran en conjunto las combinaciones XLRR y Ptokin1_2 los valores obtenidos son 79.0%, 51.6%, 44.0% y 27.0% para A. chilensis, arroz, cebada y trigo, respectivamente (Tabla III-8). Una tendencia similar se encuentra al analizar cada combinación de primers por separado. En P. oocarpa se reporta un 47.3% de polimorfismo, sobre un total de 112 bandas generadas con cuatro combinaciones de primers (Diaz y Ferrer, 2003).
Tomados en conjunto, estos datos indicarían un mayor nivel de exigencia en la normalización o en la metodología empleada para determinar el nivel de reproducibilidad de las bandas detectadas en A. chilensis. Es importante mencionar que el número total de fragmentos amplificados aplicando el sistema RGA es, en general muy elevado, y que diferencias leves en la metodología de score llevan a diferencias marcadas en el número final de fragmentos. Para la construcción de un mapa de ligamiento en tomate, basado en la hibridación de Lycopersicon esculentumMill. y L. hirsutum Humb. Bonpl., Zhang et al. (2002) emplearon 10 combinaciones de primers y amplificaron 600 fragmentos de los cuales 100 fueron reproducibles y 46 polimórficos. En este trabajo con A. chilensis para las cuatro combinaciones de primers en conjunto, se obtuvo un total de 465 fragmentos con señal fluorescente > de 50 unidades. El valor se redujo a 53 fragmentos luego de la normalización de los datos y la evaluación de la reproducibilidad, siendo 43 de ellos polimórficos.
Los resultados obtenidos indican, por tanto, que la especie A. chilensis presenta regiones genómicas que pueden ser amplificadas mediante PCR empleando primers específicos diseñados sobre dominios conservados presentes en genes de resistencia a enfermedades y que
el sistema RGA genera un número de marcadores con nivel de polimorfismo suficiente para su aplicación en la caracterización genética de la especie.