PREPARACIÓN DE HMCs BASADOS EN GO
6.1 CARBONES JERÁRQUICOS PARA REGENERACIÓN TISULAR
El aumento de la prevalencia y el elevado coste sanitario de las lesiones que afectan al sistema nervioso central (CNS) en la médula espinal ha animado a los expertos de diferentes campos a explorar nuevas formas de reparación del daño neuronal. Las lesiones del CNS (provocadas por una contusión, compresión o extensión) impiden la llegada de glucosa y oxígeno al tejido provocando la muerte de algunas neuronas y el daño de los axones, que interrumpe la transmisión de la información (sinápsis) en otras. Además, tras el proceso traumático comienza un proceso inflamatorio que desencadena en una serie compleja de eventos que conllevan la activación de células gliales y fibroblastos, y que resulta en una cicatrización descontrolada. Esta cicatriz recibe el nombre de cicatriz glial y supone una barrera para la reconexión neuronal por ser un medio hostil para la regeneración de los axones.
De esta manera, la formación de la cicatriz glial, que originariamente es un proceso autoterapéutico desarrollado por el propio organismo para limitar localmente la lesión, se convierte en el principal impedimento para la regeneración y reconexión de los axones. En este contexto, la búsqueda de nuevos materiales que permitan (1) prevenir la formación de cicatrices fibrogliales inhibidoras de la formación de tejido nervioso y (2) superar la reducida capacidad de regeneración del tejido, tiene un enorme interés. Entre otros, los materiales formados con grafeno han suscitado un enorme interés debido las excepcionales propiedades que presentan en términos de conductividad eléctrica, ductilidad, dureza, y biocompatibilidad (Apartado 1.1.1). Dichas propiedades constituyen un fuerte incentivo para las aplicaciones de este tipo de materiales en biomedicina y, en particular, en el campo de la regeneración de tejido nervioso, donde la conductividad del biomaterial permite explorar la utilización de procesos de electroestimulación que favorezcan la regeneración y reconexión de los axones.
Figura 6.1. Modelo de células neuronales acompañadas por células gliales interviniendo en un proceso sináptico.
Un aspecto a destacar de nuestro trabajo es el uso de soportes tridimensionales (3D). Aunque el trabajo con este tipo de soportes es complejo, al menos más que con los soportes bidimensionales (2D) habituales, la comunidad científica trabajando en este tema coincide en la mayor utilidad de la información obtenida de los experimentos in-
vitro con soportes 3D, de cara a futuros experimentos in-vivo. Por este motivo, el
trabajo aquí presentado pretende emplear HMCs basados en un derivado de grafeno y con alta porosidad en la escala macrométrica como soportes 3D (o scaffolds) para regeneración neural y reconexión de axones.
6.1.1.-ARTÍCULO V
Aunque todavía existe cierta controversia sobre la biocompatibilidad del grafeno y sus derivados, los últimos trabajos científicos indican que se trata de un material no citotóxico en, al menos, un cierto rango de condiciones [1]. El reciente interés en el uso de materiales basados en grafeno para regeneración tisular ha surgido tras la observación de que ciertas películas delgadas de grafeno recubiertas con laminina son capaces de promover la diferenciación preferencial de células madre de tejido nervioso a neuronas adultas diferenciadas (en lugar de a células gliales) en cultivos celulares humanos [2]. También, se ha podido observar que ciertas células madre de tipo mesenquimal presentaron un notable grado de diferenciación a neuronas adultas – incluso en ausencia de inductores – cuando los cultivos se hicieron sobre películas delgadas de derivados fluorados de grafeno [3].
La mayoría del grafeno utilizado en el campo de la biomedicina ha sido generado vía deposición química en fase vapor (CVD) por lo que los trabajos basados en uso de óxido de grafeno (GOx) o GOx parcialmente reducido son pocos aunque prometedores. Por ejemplo, uno de estos trabajos demostró que el recubrimiento mediante nanoláminas de GOx de nanoparticulas de sílice también es capaz de promover la diferenciación neuronal y el alineamiento axonal en cultivos de células madre de tejido nervioso [4], mientras que otros trabajos más recientes han mostrado la capacidad de GOx para promover la diferenciación de células madre a neuronas de tipo dopaminérgico u oligodendocitos [5].
Por otro lado, el diseño un soporte artificial para ingeniería de tejidos que imite la tridimensionalidad de los tejidos y órganos nativos es, como se ha mencionado antes,
1 (a) Pinto AM et al., “Graphene-based materials biocompatibility: A review”. Colloids and
Surfaces B: Biointerfaces 2013, 111, 188-202.
(b) Hu X et al., “Health and Ecosystem Risks of Graphene”, Chemical Reviews 2013, 113 (5), 3815-3835.
(c) Yang K et al., “Behavior and toxicity of graphene and its functionalized derivatives in biological systems”. Small 2013, 9 (9-10), 1492-1503.
(d) Bussy C et al., “Safety Considerations for Graphene: Lessons Learnt from Carbon Nanotubes”. Accounts of Chemical Research 2013, 46 (3), 692-701.
2 Park SY et al., “Enhanced Differentiation of Human Neural Stem Cells into Neurons on Graphene” Advanced Materials 2011, 23 (36), H263-H267.
3 Wang Y et al., “Fluorinated Graphene for Promoting Neuro-Induction of Stem Cells”.
Advanced Materials 2012, 24 (31), 4285-4290.
4 Solanki A et al., “Axonal Alignment and Enhanced Neuronal Differentiation of Neural Stem Cells on Graphene-Nanoparticle Hybrid Structures”. Advanced Materials 2013, 25 (38), 5477-5482.
5 (a) Yang D et al., “Graphene oxide promotes the differentiation of mouse embryonic stem cells to dopamine neurons”. Nanomedicine 2014, 9 (16), 2445-2455.
(b) Shah S et al., “Guiding Stem Cell Differentiation into Oligodendrocytes Using Graphene- Nanofiber Hybrid Scaffolds”. Advanced Materials 2014, 26 (22), 3673-3680.
muy útil pero indudablemente complejo. Por un lado, debe ser lo suficientemente robusto en términos mecánicos como para permitir su manejo, pero además, para futuras aplicaciones in vivo, debe ser biodegradable o al menos susceptible de desintegrarse en pequeños fragmentos que puedan ser eliminados del cuerpo sin acumularse de manera dañina en ningún órgano. En este sentido, ciertos composites tridimensionales (3D) de grafeno merecen atención dado que han mostrado excelentes propiedades mecánicas que facilitan su manejo y su estructura 3D podría eventualmente desensamblarse en las unidades discretas de grafeno que la forman. La mayoría de las estructuras 3D preparadas hasta la fecha tanto con grafeno como con GOx han sido obtenidas mediante métodos hidrotermales, reducciones químicas seguidas de liofilización, CVD sobre plantillas tridimensionales, o moldeados con hielo, y han sido utilizados mayoritariamente en aplicaciones ambientales y energéticas [6]. En los pocos casos aplicados a la biomedicina y reparación neuronal, las soportes 3D han sido de grafeno. En este trabajo se han preparado soportes 3D de GOx y se ha comparado la proliferación de neuronas y astrocitos a partir de células madre neuronales con respecto a la misma proliferación en películas 2D del mismo GOx. En este caso, la preparación de los soportes 3D o scaffolds no se realizó como en los casos anteriores sino que se utilizó la metodología ISISA, que ya se describió en detalle con anterioridad (Apartado 1.5.3). A pesar de las significativas diferencias que existen entre los HMCs descritos en otros capítulos y los soportes 3D de GOx preparados en este, la definición de HMC también aplica a estos últimos. Es cierto que, en este último caso, la funcionalidad del material no viene determinada por la existencia de microporos, por lo que la existencia o no de estos no se ha investigado en este capítulo. En estas circunstancias, la jerarquía en estos materiales no puede atribuirse a la existencia de una porosidad bimodal con macro y microporos sino a la forma en que unidades discretas de GOx de tamaño nanométrico se autoensamblan formando un monolito estructurado en forma de canales macroporosos como resultado del proceso de congelación unidireccional y posterior liofilización.
El GOx utilizado en este capítulo para la preparación de HMCs fue obtenido por una variante del método de Hummers y se caracterizó mediante FTIR, Raman, TEM y XPS para conocer sus características fisicoquímicas. En concreto, se observó la presencia de grupos hidrofílicos oxigenados que reducen la aglomeración de las láminas y son
6 Nardecchia S et al., “Three dimensional macroporous architectures and aerogels built of carbon nanotubes and/or graphene: synthesis and applications” Chemical Society Reviews 2012, 42 (2), 794-830.
capaces de actuar como centros de adhesión celular [7]. Las estructuras porosas de GOx resultantes de la aplicación de la metodología ISISA a las suspensiones acuosas de GOx se caracterizaron con SEM (y técnicas anteriormente mencionadas). La consolidación estructural de estas estructuras 3D para obtener HMCs fácilmente manipulables y resistentes a la inmersión en disoluciones acuosas (y por tanto listos para su uso en estudios con células in vitro) se realizó en dos fases. Primero se realizó un tratamiento térmico de las estructuras 3D a 200ºC para promover la reducción parcial del GOx, tal y como se refleja en los espectros de FTIR y XPS y en la pérdida de peso de la estructura (cercana al 40% como consecuencia de la eliminación de grupos funcionales oxigenados). Posteriormente, las estructuras 3D fueron expuestas a vapores de HMDI para promover el entrecruzamiento entre grupos hidroxilo de unidades de GOx adyacentes.
En este trabajo se realizaron estudios in vitro para valorar la biocompatiblidad de los HMCs y su capacidad intrínseca para promover la creación de redes neuronales altamente conectadas, ricas en dendritas y axones, y capaces de realizar conexiones sinápticas. Estos estudios fueron realizados por la Dra. Mª Concepción Serrano, del Laboratorio de Reparación Neural y Biomateriales del Hospital Nacional de Parapléjicos en Toledo.
7 Shi X et al., “Regulating Cellular Behavior on Few-Layer Reduced Graphene Oxide Films with Well-Controlled Reduction States”. Advanced Functional Mateerials 2012, 22 (4), 751- 759.